安捷倫發布用于克隆、基因表達和定量的RTPCR試劑盒
2010年1月6日，北京 –安捷倫科技公司(NYSE:A)今天宣布推出了AffinityScript 一步法 RT-PCR試劑盒。這一試劑盒的問世意味著安捷倫Stratagene 產品部又一次攜市場領先的高性能解決方案挺進一步法RT-PCR市場，致力于幫助研究者改善終點法RT-PCR的實驗結果。 AffinityScript一步法RT-PCR試劑盒是一個僅需一步反應就能簡便、高通量地完成RT-PCR反應的高效系統。該試劑盒是快速簡便地實現一步式RT-PCR的理想工具;其簡單的操作流程避免了多反應或高通量實驗準備過程中可能引入的污染。它專為研究者進行終點法RT – PCR反應而設計，能為克隆，基因檢測和定量等多種應用提供高產量和高精度的實驗結果。 “這是市場上唯一的基于酶融合技術的RT-PCR試劑盒，能加速延伸速度，大幅減少獲取結果所需的時間，并且在不影響擴增產量和模板靈敏度的情況下提高樣品通量”，安捷倫科技產......閱讀全文
基因表達－RTPCR之我見
?本文討論的范圍包括RNA酶保護分析，northernblot，原位雜交，半定量RT-PCR和定量RT-PCR。本文不談具體protocol，是因為各種書籍和kit說明書上都有，主要說一些原則，而且大部分是失敗和成功的經驗，還有小組討論結果以及各種書里七零八落看的內容，希望對大家有用。基因表達的定義
基因表達之RTPCR之我見
在論壇上看到不停地有人在問RT-PCR的問題，實際上在以前的帖子中各位香主和eeflying（我為什么總是提他們？因為還是很佩服的哦，生怕自己說錯了，被他們指出來哦）都談到了很多，鄙人也充大頭答了一些問題，但是還是有各種問題，由于的基因表達還有點實戰經驗（但也技止此而），所以想些點東西給大家參考，計
安捷倫發布用于克隆、基因表達和定量的RTPCR試劑盒
2010年1月6日，北京 –安捷倫科技公司(NYSE:A)今天宣布推出了AffinityScript 一步法 RT-PCR試劑盒。這一試劑盒的問世意味著安捷倫Stratagene 產品部又一次攜市場領先的高性能解決方案挺進一步法RT-PCR市場，致力于幫助研究者改善終點法RT-PCR的實驗結果。
小鼠βactin基因的克隆表達（1）
動物組織RNA的提取實驗目的：掌握由動物組織中提取總RNA的方法實驗原理：Trizol試劑是一個包含酚、異硫氰酸胍和SDS的單相酸性溶液，其在裂解細胞的同時抑制RNase的活性，隨后加入氯仿，酚會大量的溶解在氯仿中。由于DNA和RNA在酸性酚中的溶解性不同，造成DNA分布在下層的氯仿酚溶液中，RNA
原核表達——基因克隆技術
原核表達可以用于檢測（1）發生在原核生物內的基因表達。（2）通過基因克隆技術，將外源目的基因，通過構建表達載體并導入表達菌株的方法，使其在特定原核生物或細胞內表達。實驗方法原理一個完整的表達系統通常包括配套的表達載體和表達菌株。如果是特殊的誘導表達還包括誘導劑，如果是融合表達還包括純化系統或者Tag
小鼠βactin基因的克隆表達（2）
實驗步驟： ? （1）目的基因與表達載體的連接反應： ①表達載體和目的片段的酶切 ? 管號 ① ② pGEX 4T-1
小鼠βactin基因的克隆表達（4）
實驗步驟：（1）誘導靶蛋白表達分別挑取對照菌和重組菌1~2個菌落，接入5ml含Amp（30μg/ml）的LB培養液，37℃振蕩培養過夜。取5ml過夜培養物接入500ml含Amp（30μg/ml）的LB培養液，37℃振蕩培養2h以上，至對數中期（A550=0.5~1.0）。向誘導管中加入IPTG使其濃
小鼠βactin基因的克隆表達（3）
（2）質粒的提取及酶切鑒定分析 ? 質粒的提取按照質粒提取試劑盒的操作步驟進行，然后進行雙酶切鑒定。 ? 管號 ① ② 質粒DNA
原核表達之目的基因克隆
1. 了解實驗課題對目的蛋白的要求包括：目的蛋白分子量有多大，表達目的（是蛋白結晶、藥劑結合還是制備抗體，不同目的對蛋白要求不同）；是否要其可溶；是胞內表達還是分泌表達，是組成型表達還是誘導型表達；另外，還要了解蛋白表達后需要采用什么樣的方式進行純化，純化標簽有多大，蛋白純化后是否需要將標簽去除（即
表達基因的克隆策略與分離表達基因序列的技術方法
人類基因組計劃的主要任務之一就是要從大片段基因組區域或整條染色體DNA 上鑒定出基因表達序列(gene expressed sequences)或轉錄單位(transcription units)。在人類基因組30億個堿基對中，發生轉錄的表達序列(即基因)僅占總序列的3～5％。基因組中絕大部
克隆基因的表達（expression－of－cloned－gene）1
基因表達(gene expression)是指儲存遺傳信息的基因經過一系列步驟表現出其生物功能的整個過程。典型的基因表達是基因經過轉錄、翻譯，產生有生物活性的蛋白質的過程。基因的表達主要涉及到兩個過程：轉錄和翻譯。 ? 第一節影響外源基因表達的因素 利用基因工程技術高水平表達
克隆基因的表達（expression－of－cloned－gene）2
在雙鏈 DNA 分子中，只有一條鏈轉錄成 mRNA，這條鏈稱為有意義鏈(sense strand)，該基因的另一條鏈則稱反意義鏈(antisense strand)。在含有許多基因的 DNA 雙鏈中，每個基因的有意義鏈并不是在同一條 DNA 鏈上。也就是說，一條鏈上既具有某些基因的有意義鏈，
克隆基因的表達（expression－of－cloned－gene）3
（3）原核生物的基因組基本上是單倍體，而真核基因組是二倍體。（4）如前所述，細菌多數基因按功能相關成串排列，組成操縱元的基因表達調控的單元，共同開啟或關閉，轉錄出多順反子(polycistron)的mRNA；真核生物則是一個結構基因轉錄生成一條mRNA，即mRNA是單順反子(monocistron)
RTPCR在基因表達（gene－expression）檢測中的應用
基因表達的檢測有幾種方法。經典的方法（仍然重要）是根據在細胞或生物體中 所觀察到的生物化學或表型的變化來決定某一特定基因是否表達。隨著大分子分離技 術的進步使得特異的基因產物或蛋白分子的識別和分離成為可能。隨著重組DNA技術 的運用，現在有可能檢測．分析任何基因的轉錄產物。目前有好幾種方
TEM105編碼基因的克隆與原核表達
由于一種細菌可同時產生多種β內酰胺酶，因此為了避免多種β內酰胺酶的相互干擾，我們應用肉湯稀釋法對產超廣譜β內酰胺酶（ ESBLs ）的 4 株肺炎克雷伯菌（ Kpn ）的 TEM 型編碼基因進行了原核表達。一、 材料和方法1． 菌株來源和表型鑒定： 4 株臨床菌株 No95 、 No96 、 No1
真菌纖維素酶基因的克隆與表達
近年來，隨著現代生物技術的迅猛發展，越來越多的真菌纖維素酶基因得到克隆和表達。經過對比發現，不同真菌菌株的同一類型的纖維素酶基因有較高的同源性，但同一菌種不同類型的纖維素酶基因間的同源性相對較低[8]。已知里氏木霉有8個纖維素酶基因得到克隆，包括編碼纖維二糖水解酶的cbh1、cbh2和編碼內切葡聚糖
真菌纖維素酶基因的克隆與表達
隨著現代生物技術的迅猛發展，越來越多的真菌纖維素酶基因得到克隆和表達。經過對比發現，不同真菌菌株的同一類型的纖維素酶基因有較高的同源性，但同一菌種不同類型的纖維素酶基因間的同源性相對較低[8]。已知里氏木霉有8個纖維素酶基因得到克隆，包括編碼纖維二糖水解酶的cbh1、cbh2和編碼內切葡聚糖酶的eg
酵母菌載體與克隆基因表達產物的檢測
? ? ? ? ? ? 實驗方法原理 實驗材料 包含lacZ融合基因的酵母菌株 試劑、試劑盒 選擇培
酵母菌載體與克隆基因表達產物的檢測
實驗方法原理 實驗材料 包含lacZ融合基因的酵母菌株試劑、試劑盒 選擇培養基平板液氮Z緩沖液20 mg mL×-gal溶于二甲基甲酰胺儀器、耗材 30℃孵育箱圓形硝酸纖維素濾膜Whatman 3MM 濾紙實驗步驟 1)在含有適當選擇培養基的培養平板上點接種或者劃線接種酵母菌克隆，在30℃培養直至生
酵母菌載體與克隆基因表達產物的檢測
構建LacZ融合載體研究酵母菌基因調控。由于這種檢測方法簡便而且靈敏度高，因此，酵母菌基因經常以LacZ基因的功能 部分作標簽，來指示待研究酵母菌基因的表達調節功能。融合蛋白被這樣構建：酵母基因的啟動子加上這個基因編碼蛋白的N端的幾個氨基酸殘基融合在LacZ基因的羧基 端，由此編碼的蛋白質片段仍保持
微生物克隆系統使重組基因表達的篩選更加容易
傳統的手工挑取微生物克隆是一個費時煩人且易出錯的過程。微生物克隆篩選系統一小時可以完成3000 個克隆的挑取，而一個熟練的人工只能挑取約600 個克隆。自動化系統的速度相比人工提高了至少5 倍，最關鍵的是更加準確，有效性>98%。微生物克隆篩選系統的熒光成像模塊可以顯著減少下游的工作量，因為通過
微生物克隆系統使重組基因表達的篩選更加容易
傳統的手工挑取微生物克隆是一個費時煩人且易出錯的過程。微生物克隆篩選系統一小時可以完成3000 個克隆的挑取，而一個熟練的人工只能挑取約600 個克隆。自動化系統的速度相比人工提高了至少5 倍，最關鍵的是更加準確，有效性>98%。微生物克隆篩選系統的熒光成像模塊可以顯著減少下游的
微生物克隆系統使重組基因表達的篩選更加容易
傳統的手工挑取微生物克隆是一個費時煩人且易出錯的過程。微生物克隆篩選系統一小時可以完成3000 個克隆的挑取，而一個熟練的人工只能挑取約600 個克隆。自動化系統的速度相比人工提高了至少5 倍，最關鍵的是更加準確，有效性>98%。微生物克隆篩選系統的熒光成像模塊可以顯著減少下游的工作量，因為通過
基因克隆
外源DNA和質粒載體的連接反應?外源ＤＮＡ片段和線狀質粒載體的連接，也就是在雙鏈ＤＮＡ５'磷酸和相鄰的3'羥基之間?形成的新的共價鏈。如質粒載體的兩條鏈都帶5'磷酸，可生成４個新的磷酸二酯鏈。但如果質粒ＤＮＡ已去磷酸化，則吸能形成２個新的磷酸二酯鏈。在這種情況下產生的兩個雜交
分子克隆蛋白表達實驗指南（十四）
RbCl制備感受態細胞? 需準備的滅菌器具和培養液：? SOB，Buffer 1，Buffer 2，3×200ml廣口瓶，1.5ml ? EP管，1×500ml離心瓶（按200ml搖菌量計算），2×50ml離心管，2×移液管（用于加Buffer 1），液氮，冰? 離心管，EP管，移液管使用前均需要放
分子克隆蛋白表達實驗指南（十八）
15％膠????????? ??????? 水1.11.872.33.43.854.65.76.99.211.5??????? 30％聚丙烯酰胺混合液2.54.2557.58.751012.5152025??????? 1.5M Tris(pH=8.8)1.32.212.53.84.5556.37.
分子克隆蛋白表達實驗指南（三）
若有非特異性條帶，可進行Touchdown PCR，提高引物的特異性。???? PCR反應條件：??????????? 1????? 94C???? 5min??????????? 2????? 94C???? 45s??????????? 3????? 65C???? 45s????? 退火溫度視
分子克隆蛋白表達實驗指南（十五）
? LB固體培養基????????? Tryptone????????????? 1g????????? Yeast Extract?????????? 0.5g????????? NaCl???????????????? 1g? Agar???????????????? 1.5g? 加蒸餾水至總體
分子克隆蛋白表達實驗指南（五）
8. TA質粒轉化菌落的驗證? 與表達載體的驗證不同，轉化TA質粒時不用雙酶切驗證。只需用目的基因引物和TA載體引物PCR驗證即可。TA載體引物PCR片段比插入片段大約長150bp。? 目的基因退火溫度與之前膠回收時溫度相同，TA退火溫度60C即可，但可在55～70之間變動，不會影響結果。? 挑取至
分子克隆蛋白表達實驗指南（十七）
Buffers for His purification in denatured conditions:????? 配制時加終體積50％的水，之后定容至所需體積。先配pH 8.0的buffer(調pH需要較多NaOH)，再統一配bufferC，D，E，分別調pH?? Buffer B (200ml