克隆基因的表達（expressionofclonedgene）2
在雙鏈 DNA 分子中，只有一條鏈轉錄成 mRNA，這條鏈稱為有意義鏈(sense strand)，該基因的另一條鏈則稱反意義鏈(antisense strand)。在含有許多基因的 DNA 雙鏈中，每個基因的有意義鏈并不是在同一條 DNA 鏈上。也就是說，一條鏈上既具有某些基因的有意義鏈，也含有另外一些基因的反意義鏈。由于 mRNA 聚合酶是沿著 DNA 鏈的 3’→5’方向移動，DNA 鏈與合成的 RNA鏈有反平行關系，所以 mRNA 鏈的合成方向是 5’→3’，mRNA 上的信息的閱讀是從多核苷酸鏈 5'末端向 3’末端進行。從轉錄和翻譯的方向也可看出，在原核生物細胞內當 mRNA的合成還沒有完成時，蛋白質或多膚的翻譯就己經開始了。④原核基因一般不含有內含子(intron)，在原核細胞中缺乏真核細胞的轉錄后加工系統。因此當克隆的含有內含子的真核基因在原核細胞中轉錄成 mRNA 前體后，其中內含子......閱讀全文
小鼠βactin基因的克隆表達（2）
實驗步驟： ? （1）目的基因與表達載體的連接反應： ①表達載體和目的片段的酶切 ? 管號 ① ② pGEX 4T-1
小鼠βactin基因的克隆表達（4）
實驗步驟：（1）誘導靶蛋白表達分別挑取對照菌和重組菌1~2個菌落，接入5ml含Amp（30μg/ml）的LB培養液，37℃振蕩培養過夜。取5ml過夜培養物接入500ml含Amp（30μg/ml）的LB培養液，37℃振蕩培養2h以上，至對數中期（A550=0.5~1.0）。向誘導管中加入IPTG使其濃
原核表達——基因克隆技術
原核表達可以用于檢測（1）發生在原核生物內的基因表達。（2）通過基因克隆技術，將外源目的基因，通過構建表達載體并導入表達菌株的方法，使其在特定原核生物或細胞內表達。實驗方法原理一個完整的表達系統通常包括配套的表達載體和表達菌株。如果是特殊的誘導表達還包括誘導劑，如果是融合表達還包括純化系統或者Tag
原核表達之目的基因克隆
1. 了解實驗課題對目的蛋白的要求包括：目的蛋白分子量有多大，表達目的（是蛋白結晶、藥劑結合還是制備抗體，不同目的對蛋白要求不同）；是否要其可溶；是胞內表達還是分泌表達，是組成型表達還是誘導型表達；另外，還要了解蛋白表達后需要采用什么樣的方式進行純化，純化標簽有多大，蛋白純化后是否需要將標簽去除（即
小鼠βactin基因的克隆表達（1）
動物組織RNA的提取實驗目的：掌握由動物組織中提取總RNA的方法實驗原理：Trizol試劑是一個包含酚、異硫氰酸胍和SDS的單相酸性溶液，其在裂解細胞的同時抑制RNase的活性，隨后加入氯仿，酚會大量的溶解在氯仿中。由于DNA和RNA在酸性酚中的溶解性不同，造成DNA分布在下層的氯仿酚溶液中，RNA
小鼠βactin基因的克隆表達（3）
（2）質粒的提取及酶切鑒定分析 ? 質粒的提取按照質粒提取試劑盒的操作步驟進行，然后進行雙酶切鑒定。 ? 管號 ① ② 質粒DNA
表達基因的克隆策略與分離表達基因序列的技術方法
人類基因組計劃的主要任務之一就是要從大片段基因組區域或整條染色體DNA 上鑒定出基因表達序列(gene expressed sequences)或轉錄單位(transcription units)。在人類基因組30億個堿基對中，發生轉錄的表達序列(即基因)僅占總序列的3～5％。基因組中絕大部
克隆基因的表達（expression－of－cloned－gene）3
（3）原核生物的基因組基本上是單倍體，而真核基因組是二倍體。（4）如前所述，細菌多數基因按功能相關成串排列，組成操縱元的基因表達調控的單元，共同開啟或關閉，轉錄出多順反子(polycistron)的mRNA；真核生物則是一個結構基因轉錄生成一條mRNA，即mRNA是單順反子(monocistron)
克隆基因的表達（expression－of－cloned－gene）1
基因表達(gene expression)是指儲存遺傳信息的基因經過一系列步驟表現出其生物功能的整個過程。典型的基因表達是基因經過轉錄、翻譯，產生有生物活性的蛋白質的過程。基因的表達主要涉及到兩個過程：轉錄和翻譯。 ? 第一節影響外源基因表達的因素 利用基因工程技術高水平表達
克隆基因的表達（expression－of－cloned－gene）2
在雙鏈 DNA 分子中，只有一條鏈轉錄成 mRNA，這條鏈稱為有意義鏈(sense strand)，該基因的另一條鏈則稱反意義鏈(antisense strand)。在含有許多基因的 DNA 雙鏈中，每個基因的有意義鏈并不是在同一條 DNA 鏈上。也就是說，一條鏈上既具有某些基因的有意義鏈，
TEM105編碼基因的克隆與原核表達
由于一種細菌可同時產生多種β內酰胺酶，因此為了避免多種β內酰胺酶的相互干擾，我們應用肉湯稀釋法對產超廣譜β內酰胺酶（ ESBLs ）的 4 株肺炎克雷伯菌（ Kpn ）的 TEM 型編碼基因進行了原核表達。一、 材料和方法1． 菌株來源和表型鑒定： 4 株臨床菌株 No95 、 No96 、 No1
真菌纖維素酶基因的克隆與表達
隨著現代生物技術的迅猛發展，越來越多的真菌纖維素酶基因得到克隆和表達。經過對比發現，不同真菌菌株的同一類型的纖維素酶基因有較高的同源性，但同一菌種不同類型的纖維素酶基因間的同源性相對較低[8]。已知里氏木霉有8個纖維素酶基因得到克隆，包括編碼纖維二糖水解酶的cbh1、cbh2和編碼內切葡聚糖酶的eg
真菌纖維素酶基因的克隆與表達
近年來，隨著現代生物技術的迅猛發展，越來越多的真菌纖維素酶基因得到克隆和表達。經過對比發現，不同真菌菌株的同一類型的纖維素酶基因有較高的同源性，但同一菌種不同類型的纖維素酶基因間的同源性相對較低[8]。已知里氏木霉有8個纖維素酶基因得到克隆，包括編碼纖維二糖水解酶的cbh1、cbh2和編碼內切葡聚糖
酵母菌載體與克隆基因表達產物的檢測
實驗方法原理 實驗材料 包含lacZ融合基因的酵母菌株試劑、試劑盒 選擇培養基平板液氮Z緩沖液20 mg mL×-gal溶于二甲基甲酰胺儀器、耗材 30℃孵育箱圓形硝酸纖維素濾膜Whatman 3MM 濾紙實驗步驟 1)在含有適當選擇培養基的培養平板上點接種或者劃線接種酵母菌克隆，在30℃培養直至生
酵母菌載體與克隆基因表達產物的檢測
構建LacZ融合載體研究酵母菌基因調控。由于這種檢測方法簡便而且靈敏度高，因此，酵母菌基因經常以LacZ基因的功能 部分作標簽，來指示待研究酵母菌基因的表達調節功能。融合蛋白被這樣構建：酵母基因的啟動子加上這個基因編碼蛋白的N端的幾個氨基酸殘基融合在LacZ基因的羧基 端，由此編碼的蛋白質片段仍保持
酵母菌載體與克隆基因表達產物的檢測
? ? ? ? ? ? 實驗方法原理 實驗材料 包含lacZ融合基因的酵母菌株 試劑、試劑盒 選擇培
微生物克隆系統使重組基因表達的篩選更加容易
傳統的手工挑取微生物克隆是一個費時煩人且易出錯的過程。微生物克隆篩選系統一小時可以完成3000 個克隆的挑取，而一個熟練的人工只能挑取約600 個克隆。自動化系統的速度相比人工提高了至少5 倍，最關鍵的是更加準確，有效性>98%。微生物克隆篩選系統的熒光成像模塊可以顯著減少下游的工作量，因為通過
微生物克隆系統使重組基因表達的篩選更加容易
傳統的手工挑取微生物克隆是一個費時煩人且易出錯的過程。微生物克隆篩選系統一小時可以完成3000 個克隆的挑取，而一個熟練的人工只能挑取約600 個克隆。自動化系統的速度相比人工提高了至少5 倍，最關鍵的是更加準確，有效性>98%。微生物克隆篩選系統的熒光成像模塊可以顯著減少下游的工作量，因為通過
微生物克隆系統使重組基因表達的篩選更加容易
傳統的手工挑取微生物克隆是一個費時煩人且易出錯的過程。微生物克隆篩選系統一小時可以完成3000 個克隆的挑取，而一個熟練的人工只能挑取約600 個克隆。自動化系統的速度相比人工提高了至少5 倍，最關鍵的是更加準確，有效性>98%。微生物克隆篩選系統的熒光成像模塊可以顯著減少下游的
基因克隆
外源DNA和質粒載體的連接反應?外源ＤＮＡ片段和線狀質粒載體的連接，也就是在雙鏈ＤＮＡ５'磷酸和相鄰的3'羥基之間?形成的新的共價鏈。如質粒載體的兩條鏈都帶5'磷酸，可生成４個新的磷酸二酯鏈。但如果質粒ＤＮＡ已去磷酸化，則吸能形成２個新的磷酸二酯鏈。在這種情況下產生的兩個雜交
分子克隆蛋白表達實驗指南（十二）
– Note: The yield of fusion protein can be estimated by measuring the ? absorbance at 280 nm. The GST affinity tag can be approximated by 1 A280 ? 0.5
Gateway技術：克隆、表達新方法
Gateway技術提供以下可能： 通過去除冗長的亞克隆步驟節省您的時間同時將您的基因轉移到多個表達系統在任何您選擇的系統――體外，細菌，酵母，昆蟲，或哺乳動物――分析表達一、一種更好的克隆方法Gateway技術能夠克隆一個或多個基因進入到任何蛋白表達系統（圖1）。這項強大的體外技術大大地簡化了基因克
分子克隆蛋白表達實驗指南（十五）
? LB固體培養基????????? Tryptone????????????? 1g????????? Yeast Extract?????????? 0.5g????????? NaCl???????????????? 1g? Agar???????????????? 1.5g? 加蒸餾水至總體
分子克隆蛋白表達實驗指南（十八）
15％膠????????? ??????? 水1.11.872.33.43.854.65.76.99.211.5??????? 30％聚丙烯酰胺混合液2.54.2557.58.751012.5152025??????? 1.5M Tris(pH=8.8)1.32.212.53.84.5556.37.
分子克隆蛋白表達實驗指南（三）
若有非特異性條帶，可進行Touchdown PCR，提高引物的特異性。???? PCR反應條件：??????????? 1????? 94C???? 5min??????????? 2????? 94C???? 45s??????????? 3????? 65C???? 45s????? 退火溫度視
分子克隆蛋白表達實驗指南（十一）
SDS-PAGE膠樣品排列：??????? MarkerUII 37CUI’I’??????? Marker：低分子量蛋白marker，上樣10ul??????? UI：未誘導菌液，上樣10ul。任取37C和20C中一個??????? I：誘導后對照，上樣10ul??????? UI’, I’代表G
分子克隆蛋白表達實驗指南（十三）
7．? ? 電泳結束后，按比例從膠上割下相應約1cm條帶（當按比例的條帶割下后可相應的向兩邊再割一點，但是電透析時中間和兩邊的膠必須分開透析），用鑷子或尺子將膠碾碎成2mm見方的小塊。? 8．? 將碎塊小心加入電透析tube中，200V，120～150min。? 9．? 移出放電透析tube的架子，
Gateway技術：克隆、表達新方法
Gateway技術提供以下可能： 通過去除冗長的亞克隆步驟節省您的時間 同時將您的基因轉移到多個表達系統 在任何您選擇的系統――體外，細菌，酵母，昆蟲，或哺乳動物――分析表達 一、一種更好的克隆方法 Gateway技術能夠克隆一個或多個基因進入到任何蛋白表達系統（圖1）。這項強大的體外技術大大
分子克隆蛋白表達實驗指南（二）
取DEPC水時切記帶上手套?? ? Genequant使用方法：? 開機－set-up－enter(只更改DNA/RNA，看光波是否為320nm)－set-ref(此時插入空白對照)－樣品? 1．使用前將比色皿中水吸出，用1ml蒸餾水重新洗滌再將比色皿中的水吸盡（先用1ml槍吸，后用100ul槍吸）
有關融合蛋白表達載體的克隆
在構建融含蛋白表達載體時除了要注意插入片段的方向、讀碼框架與載體保持一致外，注意以下問題可能會減少一些不必要的麻煩，當外源片的插入載體起始密碼的后面，另一個基因的前面時，注意檢查插入后基因的兩端是否引入了新的終止密碼，特別是用到Klenow mung bean 核酸酶，T4 Polymerase