大腸桿菌DNA聚合酶ⅠKlenow片段實驗
標記DNA的3‘末端 修復突出的3’或5‘末端 隨即寡核苷酸引物介導 實驗方法原理 選用本方法可產生用于放射自顯影的32P末端標記分子量標志物。放射自顯影帶的強度與片段長度無關，標記DNA可穩定數月之久。 實驗材料 DNA 試劑、試劑盒 dNTP 儀器、耗材 水浴鍋 實驗步驟 ......閱讀全文
大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ－Klenow片段實驗
實驗方法原理 選用本方法可產生用于放射自顯影的32P末端標記分子量標志物。放射自顯影帶的強度與片段長度無關，標記DNA可穩定數月之久。?實驗材料 DNA試劑、試劑盒 dNTP儀器、耗材 水浴鍋實驗步驟 1. ?在20 μl 反應體積中，用可產生5’突出端的限制性內切酶消化0.1~0.4 μg DNA
大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ－Klenow片段實驗
標記DNA的3‘末端 修復突出的3’或5‘末端 隨即寡核苷酸引物介導 ? ? ? ? ? ? 實驗方法原理 選用本方法可產生用于放射自顯影的32P末端標記分子量
大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ－Klenow片段實驗——標記DNA的3‘末端
實驗方法原理選用本方法可產生用于放射自顯影的32P末端標記分子量標志物。放射自顯影帶的強度與片段長度無關，標記DNA可穩定數月之久。?實驗材料DNA試劑、試劑盒dNTP儀器、耗材水浴鍋實驗步驟1. ?在20 μl 反應體積中，用可產生5’突出端的限制性內切酶消化0.1~0.4 μg DNA。?2.
用大腸桿菌－DNA－聚合酶－I－Klenow－片段及單鏈－DNA－模板進行...
用大腸桿菌 DNA 聚合酶 I Klenow 片段及單鏈 DNA 模板進行雙脫氧測序實驗試劑、試劑盒 dATP去離子蒸餾水EDTA延伸 終止混合液和示蹤混合液甲酰胺上樣緩沖液Tris-Cl酶和緩沖液大腸桿菌 DNA 聚合酶ⅠKienow 片段核酸和寡聚核苷酸寡核苷酸引物單鏈 DNA 模板放射性化合物
用大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段標記雙鏈DNA的3’端
? ? ? ? ? ? 實驗材料 限制性內切核酸酶 大腸桿菌 DNA 聚合酶 I Klenow 片段 模板 DNA 試劑、試劑盒
用大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段標記雙鏈DNA的3’端
實驗材料限制性內切核酸酶大腸桿菌 DNA 聚合酶 I Klenow 片段模板 DNA試劑、試劑盒乙酸銨乙醇dNTP 溶液儀器、耗材Sephadex G-50 離心柱水浴實驗步驟一、材料1. 緩沖液和溶液乙酸銨（10 mol/L )乙醇2. 酶和緩沖液適宜的限制性內切核酸酶大腸桿菌 DNA 聚合酶 I
用大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段標記雙鏈DNA的3’端
實驗材料?限制性內切核酸酶大腸桿菌 DNA 聚合酶 I Klenow 片段模板 DNA試劑、試劑盒?乙酸銨乙醇dNTP 溶液儀器、耗材?Sephadex G-50 離心柱水浴實驗步驟 一、材料1. 緩沖液和溶液乙酸銨（10 mol/L )乙醇2. 酶和緩沖液適宜的限制性內切核酸酶大腸桿菌 DNA 聚
用大腸桿菌－DNA－聚合酶－I－Klenow－片段進行雙脫氧測序實驗
當 Sanger 及其同事建立第一個 DNA 鏈終止延伸法時，只有一種合適的 DNA 聚合酶可用，即大腸桿菌 DNA 聚合酶 I Klenow 片段。它具有在模板存在時聚合 dNTP 的活性，但缺乏完整聚合酶 I 的 5'-3'外切酶活性。本實驗來源于分子克隆實驗指南（第三版）下冊，
大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ－Klenow片段實驗——修復突出的3’或5‘末端
Klenow酶是大腸桿菌八聚合酶I的羧基端片段，它具有DNA聚合酶和3’到5’方向的外切酶活性，不含5’到3”方向的外切酶活性。實驗材料DNA試劑、試劑盒限制性內切酶EDTA儀器、耗材水浴鍋實驗步驟1. ?在20 μl 反應體積中，用限制性內切酶消化0.1~4 μg DNA。2. ?加入1 μl 0
大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ－Klenow片段實驗—隨即寡核苷酸引物介導
實驗方法原理此法是一種用以產生高放射比活、放射標記均勻分布的04八片段的切口平移方法。實驗材料DNA試劑、試劑盒TEdNTP儀器、耗材水浴鍋實驗步驟1. ?用合適的限制性內切酶消化DNA，DNA片段經電泳純化或乙醇沉淀，用TE緩沖液重懸。?2. ?在冰浴中混合下列物質：（1）2.5 μl 0.5mm
大腸桿菌DNA聚合酶的介紹
大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ（DNApolymeraseⅠ，DNApolⅠ）這是1956年由ArthurKornberg首先發現的DNA聚合酶，又稱Kornber酶。此酶研究得清楚而且代表了其他DNA聚合酶的基本特點。 ⑴理化性質：純化的DNApolⅠ由一條 多肽鏈組成，約含1000個 氨基酸殘基，
大腸桿菌－DNA－－I－Klenow－片段及單鏈－DNA－模板進行雙脫氧實驗
? ? ? ? ? ? 試劑、試劑盒 dATP 去離子蒸餾水 EDTA 延伸 終止混合液 和示蹤混合液 甲酰胺上樣緩沖液 Tris-Cl
DNA聚合酶及其應用
（一）大腸桿菌DNA聚合酶I是Kornberg A. 1956年首先從大腸桿菌E。Coli 細胞中分離出來的。它是一種多功能性的酶，包括 3種不同的酶活力：5′→ 3′聚合酶活性（模板， 帶3′－OH游離基團的引物、4dNTPs、 Mg2+ ）。雙鏈特異性的5'→3'核酸外切酶活性。
DNA聚合酶及其應用
（一）大腸桿菌DNA聚合酶I是Kornberg A. 1956年首先從大腸桿菌E。Coli 細胞中分離出來的。它是一種多功能性的酶，包括 3種不同的酶活力：5′→ 3′聚合酶活性（模板， 帶3′－OH游離基團的引物、4dNTPs、 Mg2+ ）。雙鏈特異性的5'→3'核酸外切酶活性。
大腸桿菌DNA聚合酶I－的三種用途
1.利用缺口轉移法制備高比活度的DNA探針利用其5′--3′的外切酶活性及其聚合酶活性。2.用于DNA連接前的大缺口填充利用5′--3′的聚合酶活性。3.用于DNA的序列分析利用5′--3′的聚合酶活性。
基因工程的載體和工具酶5
（二）Klenow片段酶Klenow片段是大腸桿菌聚合酶 I 全酶經枯草桿菌蛋白酶處理后產生的大片段酶分子，分子量為76KD 。酶催活性：⑴5’ →3’ 的聚合酶活性 ⑵3’→5’ 的核酸外切酶活性Klenow片段的主要用途（利用5’ →3’ 的聚合酶活性）：⑴修補限制性酶消化DNA形成的3
PCR儀改進與完善
Mullis最初使用的DNA聚合酶是大腸桿菌 DNA 聚合酶 I 的Klenow片段，其缺點是：①Klenow酶不耐高溫， 90℃會變性失活，每次循環都要重新加。②引物鏈延伸反應在37℃下進行，容易發生模板和引物之間的堿基錯配，其PCR產物特異性較差，合成的DNA片段不均一。此種以Klenow酶催化
pcr儀的改進與完善
Mullis最初使用的DNA聚合酶是大腸桿菌 DNA 聚合酶 I 的Klenow片段，其缺點是： ①Klenow酶不耐高溫， 90℃會變性失活，每次循環都要重新加。 ②引物鏈延伸反應在37℃下進行，容易發生模板和引物之間的堿基錯配，其PCR產物特異性較差，合成的DNA片段不均一。此種以Kle
基因操作的工具酶2
（三） DNA連接酶的反應條件影響連接效率的因素有：1. 溫度（通常在4-15℃ ）2. ATP的濃度(10μM／L - 1mM／L )3. 連接酶濃度（一般平末端大約需1～2U，黏性末端僅需0.1U）4. 反應時間（通常連接過夜）5. 插入片段和載體片段的摩爾比（ 1∶1～5∶1）（四）T4 DN
PCR儀技術簡史
PCR的最早設想?核酸研究已有100多年的歷史，本世紀60年代末、70年代初人們致力于研究基因的體外分離技術，Korana于1971年最早提出核酸體外擴增的設想：“經過DNA變性，與合適的引物雜交，用DNA聚合酶延伸引物，并不斷重復該過程便可克隆tRNA基因”。PCR的實現?1985年美國PE-Ce
PCR簡介/PCR儀
PCR的要素基本的PCR須具備PCR儀圖冊1.要被復制的DNA模板 Template2.界定復制范圍兩端的引物Primers.3.DNA聚合酶Taq. Polymearse4.合成的原料（四種脫氧核苷酸）及水。 PCR儀工作原理利用升溫使DNA變性，在聚合酶的作用下使單鏈復制成雙鏈，進而達到基因復制
DNA聚合酶及DNA連接酶的功能和區別
DNA聚合酶，以已有的核酸序列作為模板，將4種脫氧核苷酸（A、T、G、C）按照模板的堿基排列順序，以“堿基互補原則”依次連接，聚合成為一條新的DNA鏈。 DNA連接酶，是將DNA片段上的缺刻連接起來的酶。? ? 一、DNA聚合酶? ? （一）DNA聚合酶I?? ? DNA聚合酶I（DNA pol
影響PCR的主要因素（溫度循環參數、引物設計與DNA聚合...2
1．Taq DNA聚合酶用Taq DNA聚合酶代替大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段是使PCR普及應用的關鍵。Klenow片段不能耐受95℃的雙鏈DNA變性溫度，所以每次循環都要加入新酶；而Taq DNA聚合酶可以耐受93～95℃的高溫，避免了不斷補加多聚酶的繁瑣操作，同時使退火和
關于基因擴增技術—聚合酶鏈反應的特異性介紹
首次報導的基因擴增技術—聚合酶鏈反應所用的DNA聚合酶是大腸桿菌的DNAPolymerase I的Klenow大片段，其酶活性在90℃會變性失活，需每次PCR循環都要重新加入Klenow大片段，同時引物是在37℃延伸（聚合）易產生模板—引物之間的堿基錯配、致特異性較差，1988年Saiki等從溫
關于工具酶的連接酶的介紹
它是一種封閉DNA鏈上缺口酶，借助ATP或NAD水解提供的能量催化DNA鏈的5'-PO4與另一DNA鏈的3'-OH生成磷酸二酯鍵。但這兩條鏈必須是與同一條互補鏈配對結合的(T4DNA連接酶除外)，而且必須是兩條緊鄰DNA鏈才能被DNA連接酶催化成磷酸二酯鍵。 連接酶有T4噬菌體
克列諾酶的基本信息
中文名稱克列諾酶英文名稱Klenow enzyme定 義枯草桿菌蛋白酶切割大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ所產生的76 kDa的片段，具有DNA聚合酶活性和3′→5′外切酶活性，但沒有完整酶的5′→3′外切酶活性。是基因操作技術常用的工具酶之一。應用學科生物化學與分子生物學（一級學科），酶（二級學科）
克列諾酶的基本信息
中文名稱克列諾酶英文名稱Klenow enzyme定 義枯草桿菌蛋白酶切割大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ所產生的76 kDa的片段，具有DNA聚合酶活性和3′→5′外切酶活性，但沒有完整酶的5′→3′外切酶活性。是基因操作技術常用的工具酶之一。應用學科生物化學與分子生物學（一級學科），酶（二級學科）
T4DNA聚合酶的酶活性
⑴5′→3′的聚合酶活性⑵3 ′→ 5 ′的核酸外切酶活性。其外切酶活性要比大腸桿菌聚合酶 I 的活性高200倍。比Klenow 片段酶強100～1,000倍。因此，可以綜合利用這兩種活性進行取代合成反應：如果反應體系中僅存在一種dNTP或沒有底物時，這時T4DNA聚合酶就會表現出3 ′→ 5 ′外
用大腸桿菌－Klenow－片段標記合成的寡核苷酸實驗
? ? ? ? ? ? 試劑、試劑盒 甲酰胺加樣緩沖液 大腸桿菌 DNA 聚合酶 IKlenow 片段 變性聚丙烯酰胺凝膠 寡核苷酸引物 寡核苷酸模板 [α-32P]dNTP
用大腸桿菌－Klenow－片段標記合成的寡核苷酸實驗
試劑、試劑盒 甲酰胺加樣緩沖液大腸桿菌 DNA 聚合酶 IKlenow 片段變性聚丙烯酰胺凝膠寡核苷酸引物 寡核苷酸模板[α-32P]dNTP儀器、耗材 磷熒光粘貼標簽水浴或模塊實驗步驟 材料溶液和緩沖液稀樣貯存液至適當濃度。甲酰胺加樣緩沖液10XKlenow 緩沖液酶與緩沖液大腸桿菌 DNA 聚合