DNA重組實驗中常用的技術（二）
DNA的重組 （一）DNA的酶切與連接 （1）酶切反應 同質粒DNA的鑒定，只不過是質粒DNA換為載體DNA。若大量酶切，則成比例增加。 （2）加2倍體積的預冷無水乙醇和1/10體積的3mol/l NaAc混勻，-20℃2h以上。 （3）15000rpm離心15min，棄上清。 （4）加入75%乙醇洗滌2次，離心棄上清，真空抽干。 （5）加入適量1×TE溶解。如此可得線性化載體DNA。 （6）測定DNA的含量。 （7）加入線性載體DNA和含量3～4倍于載體的待插入DNA片段，連接緩沖液及T4連接酶適量至總體積為20μl，在12～14℃反應12～16h。 （8）連接反應液可置-20℃保存，供轉化用。 （9）關于待插入DNA片段的獲得參見附注。 （二）大腸桿菌感受態的制備及重組DNA的轉化 1．感受態的制備 （1）接種單菌落于2ml LB培養液中， 37℃過夜。 （2）取0.25ml過夜菌入25ml L......閱讀全文
DNA重組實驗中常用的技術（二）
DNA的重組 （一）DNA的酶切與連接 （1）酶切反應 同質粒DNA的鑒定，只不過是質粒DNA換為載體DNA。若大量酶切，則成比例增加。 （2）加2倍體積的預冷無水乙醇和1/10體積的3mol/l NaAc混勻，-20℃2h以上。 （3）15000rpm離心15min，棄上清。 （4）加
DNA重組實驗中常用的技術(一）
一、質粒DNA的提取及鑒定（一）質粒DNA的提取及鑒定 1．收獲細菌 （1）將2ml含相應抗生素的LB液體培養基加入到通氣良好的15ml的試管中，接入一單菌落，于37℃劇烈振蕩培養過夜。 （2）將1.5ml培養物倒入1.5ml離心管中，用臺式離心機于4℃以12000g離心5min，將剩余的培養
DNA重組技術(Recombinant－DNA)實驗原理、用品和步驟（二）
【實驗步驟】 1．PCR產物純化 PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳，應用凝膠回收試劑盒回收純化目的DNA片段。 2．目的DNA片段連接至T/A克隆載體 即重組DNA分子的構建 反應體系及條件如下： 3．轉化 3.1 將感受態細胞置冰中融解。 3.2 將60μl感受態細胞移至無菌
DNA重組（DNA－recombination）技術：DNA重組的載體2
二、噬菌體載體作為細菌寄生物的噬菌體，大多數具有編碼多種蛋白質的基因，能利用宿主細胞的蛋白質合成體系，進行生長和增殖。構建的噬菌體載體，以λ噬菌體、M13和粘粒最為常用。㈠ λ噬菌體載體野生型λDNA是一種基因組為4.8 kb的線性雙鏈DNA，全部序列已知，共編碼50多個基因。其中約一半基因參與
DNA重組（DNA－recombination）技術：DNA重組的載體3
在作為載體時，這些噬菌體有一個很大的優點，即克隆到M13mp載體的外源DNA片段（雙鏈），在子代噬菌體便成為了單鏈形式。故應用M13mp進行克隆，可方便地分離到大量含有外源DNA某一單鏈的DNA分子。這種單鏈DNA可在下列工作中作模板：①主要用作雙脫氧鏈終止法進行DNA序列測定的模板；②制備僅有一條
DNA重組（DNA－recombination）技術：DNA重組的載體1
載體（vector）是攜帶靶DNA（目的DNA）片段進入宿主細胞進行擴增和表達的運載工具。常用的載體是通過改造天然的細菌質粒、噬菌體和病毒等構建而成。目前已構建成的載體主要有質粒載體、噬菌體載體、病毒載體和人工染色體等多種類型，亦可根據其用途不同分為克隆載體和表達載體二類。載體的構建和選擇應考慮以下
DNA重組技術
連接反應的策略?? 可以采用幾種策略來進行外源ＤＮＡ片段和質粒載體的連接。對此，可依據外源ＤＮＡ片段未的性質，以及質粒載體與外源ＤＮＡ上限制酸切位點的性質來作出選擇。（一）外源ＤＮＡ片段未的性質帶有各種未的外源ＤＮＡ的克隆方法見下表：────────────────────────────────
DNA重組技術(DNA－Recombination)
一、DNA 的酶切與連接（1）酶切反應：同質粒DNA 的鑒定，只不過是質粒DNA 換為載體DNA 。若大量酶切，則成比例增加。（2）加2倍體積的預冷無水乙醇和1/10體積的3mol/l NaAc混勻，-20℃2h以上。（3）15000rpm離心15min，棄上清。（4）加入75%乙醇洗滌2次，離心棄
重組DNA分子的轉化實驗原理和實驗步驟（二）
1.1.4接合轉化接合（Conjugation）是指通過細菌細胞之間的直接接觸導致DNA從一個細胞轉移至另一個細胞的過程。這個過程是由結合型質粒完成的，它通常具有促進供體細胞與受體細胞有效接觸的接合功能以及誘導DNA分子傳遞的轉移功能，兩者均由接合型質粒上的有關基因編碼。在DNA重組中常用的絕大多數
DNA重組（DNA－recombination）技術：DNA重組與鑒定3
當多克隆位點有外源DNA片段插入時，破壞此酶的N端閱讀框架，產生無α互補功能的N端片段，因此在帶有外源DNA片段的細菌在含有IPTG/X-gal的培養基上呈白色，見圖7-11 。如果外源DNA插入片段相當短，不破壞β-半乳糖苷酶的氨基端氨基酸序列的閱讀框，有時產生的重組體菌落不呈白色而是呈淺藍色。4
DNA重組（DNA－recombination）技術：DNA重組與鑒定1
重組DNA是在體外用限制性內切酶，將不同來源的DNA分子進行特異地切割，獲得的目的基因或DNA片段與載體重新連接，從而組成一個新的DNA雜合分子。重組的DNA分子能夠通過一定的方式進入相應的宿主細胞，在宿主細胞中進行無性增殖，獲得大量的目的基因或DNA片段，此過程稱基因克隆。重組的DNA分子也能夠在
DNA重組（DNA－recombination）技術：DNA重組與鑒定2
（1）CaCl2處理以后的轉化: 當細菌處于0℃、二價陽離子（如Ca2+、Mg2+等）低滲溶液中時，細菌細胞膨脹成球形，處于感受態；此時轉化混合物中的DNA形成抗DNA酶的羥基-鈣磷酸復合物粘附于細胞表面，重組DNA在42℃短時間熱沖擊后吸附在細胞表面，在豐富培養基中生長數小時后，球狀細胞恢復原
重組－DNA－技術介紹
中文名稱重組 DNA 技術英文名稱recombinant DNA technique定 義在體外將兩個或多個不同的DNA片段全部或部分構建成一個DNA分子的方法。應用學科細胞生物學（一級學科），細胞生物學技術（二級學科）
重組－DNA－技術簡介
中文名稱重組 DNA 技術英文名稱recombinant DNA technique定 義在體外將兩個或多個不同的DNA片段全部或部分構建成一個DNA分子的方法。應用學科細胞生物學（一級學科），細胞生物學技術（二級學科）
DNA重組技術2
?感受態細胞的制備(一)制備新鮮或冷凍的大腸桿菌感受態細胞 下述操作方案是由Hanahan(1983)提供的，所制備的大腸桿菌DHl、DH5和ＭＭ249感受態細胞培養物能使每微克超螺旋ＤＮＡ以≥5x108轉化菌落的頻率進行轉化，其他大多數大腸桿菌菌株的最高轉化率大約只有前述菌株的1/10-1/5。
DNA重組技術－連接
實驗概要? ? ? ? 體外連接獲得重組分子，用于轉化受體細胞。實驗原理? ? 質粒具有穩定可靠和操作簡便的優點。如果要克隆較小的DNA片段(＜10kb)且結構簡單，質粒要比其它任何載體都要好。在質粒載體上進行克隆，從原理上說是很簡單的，先用限制性內切酶切割質粒DNA和目的DNA片段， ?然后體外使
DNA重組技術(Recombinant－DNA)實驗原理、用品和步驟（一）
【實驗原理】1．DNA重組技術重組DNA(Recombinant DNA)技術是遺傳工程的核心技術，也是人類在基因和DNA分子水平進行操作的技術。它包括以下幾個步驟： 1）重組DNA分子的構建：即將目的基因（DNA或cDNA片段）與載體DNA重組，應用TA克隆方法,將PCR擴增產物快速克隆至質粒
DNA重組（DNA－recombination）技術：工具酶
一、限制性內切酶限制性內切酶（restriction endonucleases，RE）是其中最重要的工具酶之一。它是一類核酸水解酶，能識別和切割雙鏈DNA分子中的特定核苷酸序列。（一）命名原則限制性內切酶大多從細菌中發現，根據來源進行命名，限制酶的第一個字母（大寫，斜體）為宿主菌的屬名，第二、第三
DNA重組實驗方法
[實驗原理]DNA重組是將外源DNA與載體分子連接，這樣重新組合的DNA叫做重組體或重組子。DNA重組的方法主要有粘端連接法和平端連接法。 重組的DNA分子是在DNA連接酶的作用下，有Mg2+、ATP存在的連接緩沖系統中，將分別經酶切的載體分子與外源DNA分子進行連接。常用的DNA連接酶是T4噬
體外DNA重組技術6
六、重組質粒的轉化【實驗目的】學習和掌握感受態細胞的制備方法和轉化實驗的基本操作。【實驗原理】將重組質粒轉入大腸桿菌的過程稱為轉化。轉化所用的大腸桿菌需要用物理或化學方法特殊處理，使重組DNA分子容易進入細胞內，被處理后易于接納DNA分子的細胞稱作感受態細胞。下面介紹感受態細胞的制備。【實驗試劑與器
體外DNA重組技術2
【注意事項】基因組DNA分子量大，所有操作必須輕柔，酚/氯仿對皮膚有腐蝕作用，應該戴手套操作。二、RNA的制備【實驗目的】1.理解生物細胞中RNA制備方法的原理。2.熟悉組織細胞中RNA制備的基本操作。（一）細胞總RNA的提取1.異硫氰酸胍法【實驗原理】異硫氰酸胍法提取細胞總RNA是目前常用的提取方
體外DNA重組技術1
在體外將兩個或多個來源相同或不相同的DNA片段連接成新的重組DNA分子，再轉到特定宿主細胞中進行自主復制并表達。這是分子生物學中的基本技術。DNA重組技術的基本程序包括：（1）獲得外源DNA：外源DNA是進行DNA重組的目的DNA片段，一般采用 DNA聚合酶鏈式反應(PCR)或逆轉錄-DNA聚合酶鏈
體外DNA重組技術5
（三）DNA酶切片段的回收【實驗方法與步驟】1.凍融法:（1）在UV燈下，用手術刀片將含DNA片段的瓊脂糖凝膠切下，-70℃冷凍至少 15min，然后在65℃水浴中使膠融化；（2）加入等倍體積TE-飽和酚，劇烈振蕩30秒鐘，然后-70℃冷凍 15min；（3）室溫融化后，12,000rpm離心5mi
DNA重組技術－酶切
實驗概要? ? ? ? 通過酶切獲得可進行體外重組的載體和外源DNA實驗原理? ?DNA重組技術是用內切酶分別將載體和外源DNA切開，經分離純化后，用鏈接酶將其連接，構成新的DNA分子。? ? ?限制性內切酶能特異地結合于一段被稱為限制性酶識別序列的DNA序列之內或其附近的特異位點上，并切割雙鏈DN
體外DNA重組技術4
（二）質粒的大量制備:1.將5ml轉化菌種接種于500ml LB培養液(含用于篩選的抗生素)中，37℃以225rpm速度振蕩培養12～16小時；2.10,000rpm，4℃離心15min收集菌體；3.將細菌懸浮于100ml預冷的STE（0.1M NaCl，10mM Tris.Cl，pH8.0，1mM
體外DNA重組技術3
【實驗試劑與器材】（1）Oligo(dT)纖維素（2）層析柱裝置（3）1×上樣緩沖液：20mM Tris.Cl (pH7.6)，0.5M NaCl，1 mM EDTA.Na2 (pH8.0)，0.1%十二烷基肌氨酸鈉(SLS)配制方法: 用Tris.HCl、NaCl和EDTA母液，加入各成分確切
重組DNA技術的基本定義
重組DNA技術是指將一種生物體（供體）的基因與載體在體外進行拼接重組，然后轉入另一種生物體（受體）內，使之按照人們的意愿穩定遺傳并表達出新產物或新性狀的DNA體外操作程序，也稱為分子克隆技術。因此，供體、受體、載體是重組DNA技術的三大基本元件。
重組DNA技術的基本定義
重組DNA技術是指將一種生物體（供體）的基因與載體在體外進行拼接重組，然后轉入另一種生物體（受體）內，使之按照人們的意愿穩定遺傳并表達出新產物或新性狀的DNA體外操作程序，也稱為分子克隆技術。因此，供體、受體、載體是重組DNA技術的三大基本元件。
重組DNA技術的基本定義
重組DNA技術是指將一種生物體（供體）的基因與載體在體外進行拼接重組，然后轉入另一種生物體（受體）內，使之按照人們的意愿穩定遺傳并表達出新產物或新性狀的DNA體外操作程序，也稱為分子克隆技術。因此，供體、受體、載體是重組DNA技術的三大基本元件。
DNA重組（DNA－recombination）技術：DNA序列測定2
目前應用的兩種快速序列測定技術是Sanger等（1977）提出的酶法（雙脫氧鏈終止法）和Maxam（1977）提出的化學降解法。雖然其原理大相徑庭，但這兩種方法都同樣生成相互獨立的若干組帶放射性標記的寡核苷酸，每組核苷酸都有共同的起點，卻隨機終止于一種（或多種）特定的殘基，形成一系列以某一特定核苷酸