痘苗載體轉染細胞實驗——CaCl2法
實驗方法原理將感興趣的外源基因亞克隆到質粒轉移載體上，外源基因的兩端為痘苗病毒基因組非必需基因片段。隨后，將重組質粒轉染病毒感染的細胞，痘苗病毒基因組與質粒上同源的部分發生同源重組。應用適當的篩選方案，經幾輪噬斑純化，從細胞裂解物中獲得重組病毒。實驗材料pSCll／pRB21／pSC65／pLW9 ／其他合適載體CV-1／BS-C-1／ BHK-21 ／CEF 細胞痘苗病毒儲液試劑、試劑盒完全 MEM-10 和 MEM-2.5 培養基轉染緩沖液干冰／乙醇胰酶CaCl2儀器、耗材25 cm2 組織培養瓶聚苯乙稀管刮刀／橡皮細胞刮刀15 ml 無菌錐形離心管Sorvall 離心機實驗步驟1. 將目的基因亞克隆到 pSC11、pRB21、pSC65、pLW9 或其他合適載體的多克隆位點（MCS）上，分離質粒。2. 將 1 × 106 的 CV-1、BS-C-1，BHK-21 或 CEF 細胞用完全 MEM-10 培養基接種到......閱讀全文
痘苗病毒純化實驗
實驗方法原理 對于很多研究，部分純化的病毒就足夠了（進行到本實驗步驟 14）， 如果是純化 MVA 病毒，則不能用胰酶消化，也不能用 CEF 細胞或 BHK-21 細胞代替 HeLa 細胞。實驗材料 痘苗病毒儲液HeLa S3 細胞（懸浮培養）試劑、試劑盒 胰酶Tris ? Cl蔗糖儀器、耗材 旋轉
痘苗DNA檢測實驗
實驗方法原理 實驗材料 貼壁生長良好的單層 BS-C-1 或 HuTK-143B 細胞重組病毒噬斑懸液試劑、試劑盒 PBS胰酶／EDTA干冰／乙醇DNA 提取緩沖液乙酸鈉乙醇PCR 擴增緩沖液引物完全 MEM-10、MEM-2.5 和 MEM-5 培養基完全 MEM-10／BrdU 培養基篩選試劑4
痘苗病毒純化實驗
痘苗病毒通常采用蔗糖密度梯度離心的方法純化。純化的病毒可用于制備痘苗病毒 DNA ，用于不允許存在感染細胞蛋白污染的研究中，同時也可以用作高滴度的病毒儲液。對于大規模的純化（至少 1 L 的培養物），最好的方法是用 HeLa 細胞懸液作為感染的對象，而不要用單層培養的細胞。內容來源于《精編分子生物學
痘苗DNA檢測實驗
PCR 法 斑點雜交法 Southern 雜交法 ? ? ? ? ? ? 實驗方法原理 實驗材料
痘苗病毒純化實驗
大規模純化 ? ? ? ? ? ? 實驗方法原理 對于很多研究，部分純化的病毒就足夠了（進行到本實驗步驟 14）， 如果是純化 MVA 病毒，則不能用胰酶消化，也不能用 CEF 細胞
痘苗病毒DNA提取實驗
基本方案 ? ? ? ? ? ? 實驗方法原理 實驗材料 純化的痘苗病毒
痘苗病毒DNA提取實驗
如果提取的痘苗病毒DNA用于轉染，則應在蛋白酶 K 消化和苯酚抽提后分離。具體方法見本實驗。實驗材料純化的痘苗病毒試劑、試劑盒Tris?Cl 溶液SDS蔗糖溶液蛋白酶 K用 50 mmol／L Tris ? Cl 溶液平衡的苯酚1：1苯酚氯仿1 mol／L 乙酸鈉乙醇儀器、耗材分光光度計Sorval
痘苗病毒儲液制備
實驗材料懸浮培養的 HeLa S3 細胞痘苗病毒試劑、試劑盒完全 MEM-10 和 MEM-2.50.25 mg ml 胰酶儀器、耗材Sorvall H-6000A 轉子150 cm2 組織培養瓶CO2 培養箱實驗步驟1. 用血細胞計數器對懸浮培養的 HeLa S3 細胞進行細胞計數。2. 將 5×
痘苗病毒儲液制備
實驗方法原理 實驗材料 懸浮培養的 HeLa S3 細胞痘苗病毒試劑、試劑盒 完全 MEM-10 和 MEM-2.50.25 mg ml 胰酶儀器、耗材 Sorvall H-6000A 轉子150 cm2 組織培養瓶CO2 培養箱實驗步驟 1. 用血細胞計數器對懸浮培養的 HeLa S3 細胞進行細
痘苗載體轉染細胞實驗
CaCl2 法 DOTAP 法 ? ? ? ? ? ? 實驗方法原理 將感興趣的外源基因亞克隆到質粒轉移載體上，外源基因的兩端為痘苗病毒基因組非必需基因片段。隨后，將重組質
痘苗病毒DNA提取實驗
實驗方法原理 實驗材料 純化的痘苗病毒試劑、試劑盒 Tris?Cl 溶液SDS蔗糖溶液 蛋白酶 K用 50 mmol／L Tris ? Cl 溶液平衡的苯酚1：1苯酚氯仿1 mol／L 乙酸鈉乙醇儀器、耗材 分光光度計Sorvall 離心機實驗步驟 1. 在 260 nm 處確定純化的疸苗病毒的光密
痘苗載體轉染細胞實驗
實驗方法原理 將感興趣的外源基因亞克隆到質粒轉移載體上，外源基因的兩端為痘苗病毒基因組非必需基因片段。隨后，將重組質粒轉染病毒感染的細胞，痘苗病毒基因組與質粒上同源的部分發生同源重組。應用適當的篩選方案，經幾輪噬斑純化，從細胞裂解物中獲得重組病毒。實驗材料 pSCll／pRB21／pSC65／pLW
痘苗病毒儲液制備
基本方案 噬斑分析測定滴度 ? ? ? ? ? ? 實驗方法原理 實驗材料 懸浮培養的 HeLa S3
痘苗病毒系統基因表達實驗
重組痘苗病毒（VTF7-3）感染后的脂質體轉染 兩種重組痘苗病毒共感染細胞 ? ? ? ? ? ? 實驗方法原理 本方案從構建外源基因位于 PT7 和 T7 終止子之間的質
痘苗病毒系統基因表達實驗
實驗方法原理 本方案從構建外源基因位于 PT7 和 T7 終止子之間的質粒載體開始，然后用重組質粒通過脂質體介導轉染已經被vTF7-3（可以持續表達T7 RNA聚合酶的痘苗病毒）感染的細胞。收獲后，基因產物在細胞內的表達可以用脈沖標記的方法或用「重組痘苗病毒及其產物的鑒定實驗」中敘述的方法分
痘苗DNA檢測實驗——PCR－法
除了 PCR 和 Southern 雜交可以檢測病毒 DNA 外，也可以利用 DNA 點跡雜交方法檢測在分離的噬斑中的重組病毒。本實驗主要介紹用這3種方法來檢測痘苗DNA。實驗材料貼壁生長良好的單層 BS-C-1 或 HuTK-143B 細胞重組病毒噬斑懸液試劑、試劑盒PBS胰酶／EDTA干冰／乙醇
痘苗DNA檢測實驗——Southern－雜交法
實驗方法原理以前，用 HindIII 限制性內切核酸酶消化鑒定痕苗病毒 DNA。大部分的外源基因插入重組病毒的 TK 基因中，TK 基因位于 HindIII 5.1 kb 的 J 片段上。這樣在重組病毒中，如果插入片段上沒有 HindIII 內切酶位點，則J片段就會增大。如果缺乏 HindIII 5
痘苗病毒系統基因表達實驗（二）
實驗方法原理含有 pT7 控制的外源基因（本實驗「重組痘苗病毒（VTF7-3）感染后的脂質體轉染」）的重組質粒，通過同源重組可整合到痘苗病毒中,并制備重組病毒儲液。將此病毒儲液與 vTF7-3 共同感染貼壁或懸浮細胞，在培養過程中，外源基因被高效的 T7 RNA 聚合酶轉錄，并在感染細胞的細胞質完成
痘苗病毒系統基因表達實驗（一）
本節介紹依賴于在哺乳動物細胞質合成噬菌體 T7 RNA 聚合酶的瞬時細胞質表達系統。首先，將感興趣的基因插入質粒中，使其位于 T7 RNA 聚合酶啟動子（PT7）的控制下。應用脂質體轉染，重組質粒進入感染了 vTF7-3 的細胞質中，而 vTF7-3 是一種能編碼噬菌體T7 RNA聚合酶的重組痘苗病
痘苗載體轉染細胞實驗——DOTAP－法
實驗方法原理將感興趣的外源基因亞克隆到質粒轉移載體上，外源基因的兩端為痘苗病毒基因組非必需基因片段。隨后，將重組質粒轉染病毒感染的細胞，痘苗病毒基因組與質粒上同源的部分發生同源重組。應用適當的篩選方案，經幾輪噬斑純化，從細胞裂解物中獲得重組病毒。實驗材料pSCll／pRB21／pSC65／pLW9
痘苗DNA檢測實驗——斑點雜交法
實驗材料貼壁生長良好的單層 BS-C-1 或 HuTK-143B 細胞重組病毒噬斑懸液試劑、試劑盒NaOHTris ? Cl2×SSCPBS胰酶／EDTA干冰／乙醇DNA 提取緩沖液乙酸鈉乙醇PCR 擴增緩沖液引物完全 MEM-10、MEM-2.5 和 MEM-5 培養基完全 MEM-10／BrdU
痘苗載體轉染細胞實驗——CaCl2－法
實驗方法原理將感興趣的外源基因亞克隆到質粒轉移載體上，外源基因的兩端為痘苗病毒基因組非必需基因片段。隨后，將重組質粒轉染病毒感染的細胞，痘苗病毒基因組與質粒上同源的部分發生同源重組。應用適當的篩選方案，經幾輪噬斑純化，從細胞裂解物中獲得重組病毒。實驗材料pSCll／pRB21／pSC65／pLW9
痘苗病毒儲液制備——噬斑分析測定滴度
實驗方法原理經胰酶作用的系列稀釋病毒儲液常被用于感染適當的細胞系。經過幾天的培養后，吸出培養基，將細胞用結晶紫染色。由于感染細胞變縮、變圓和脫落，形成直徑 1～2 mm 顏色較淡的噬斑。實驗材料生長良好的貼壁培養的單層 BSC-1 細胞病毒儲液試劑、試劑盒0.1% 結晶紫（溶于 20% 乙醇）儀器、
T7RNA聚合酶系統基因表達實驗（一）
本節介紹依賴于在哺乳動物細胞質合成噬菌體T7 RNA聚合酶的瞬時細胞質表達系統。首先，將感興趣的基因插入質粒中，使其位于T7 RNA聚合酶啟動子（PT7）的控制下。在培養過程中，外源基因被高效的 T7 RNA聚合酶轉錄。這種轉染方案適用于分析的目的，因為不需要構建新的重組病毒，所以比較簡單。對于大規
以毒攻毒殺死腫瘤，這項作價千萬元成果獲批臨床
“我們的成果一旦邁入產業化，腫瘤患者只需打一針就有望治愈，費用將是現在的幾十分之一。”浙江理工大學生命科學與醫藥學院教授李恭楚的這個愿望即將實現。日前，他團隊研發的腫瘤藥物“GC001溶瘤痘苗病毒注射液”正式獲得國家藥品監督管理局臨床試驗批件。“溶瘤痘苗病毒改造技術是浙江理工大學首個技術作價成果，也
T7RNA聚合酶系統基因表達實驗
兩種重組痘苗病毒共感染細胞 單病毒感染OST7-1細胞 利用VOTE系統 ? ? ? ? ? ? 實驗方法原理 含有 pT7 控制的外源基因（「痘苗病毒系統基
我國艾滋病疫苗開始I期臨床試驗
據科技日報北京12月1日電 在第20個世界艾滋病日到來之際，我國艾滋病研究又傳來振奮消息：DNA—天壇痘苗復合型艾滋病疫苗于今天在北京協和醫院開始第一組志愿者的疫苗接種，這標志著我國用一種全新方法研制的艾滋病疫苗進入Ⅰ期臨床試驗。該艾滋病疫苗是在國家863計劃課題及歐盟第五框架INCO項目的資助下，
T7RNA聚合酶系統基因表達實驗
實驗方法原理 含有 pT7 控制的外源基因（「痘苗病毒系統基因表達實驗」中「重組痘苗病毒（VTF7-3）感染后的脂質體轉染」）的重組質粒，通過同源重組可整合到痘苗病毒中,并制備重組病毒儲液。將此病毒儲液與 vTF7-3 共同感染貼壁或懸浮細胞，在培養過程中，外源基因被高效的 T7 RNA
經典免疫學時期概述
? 這一時期起始于18世紀末至20世紀中。其特點是人們對免疫功能的認識從人體現象的觀察進入了科學實驗時期。它的發展是與微生物學的發展密切相關的，并成為微生物學的一個分支。這一時期內的重要成就如下述。 1．牛痘苗的發明 繼人痘苗之后，免疫學的一個重要發展首推牛痘苗的發明。它不但彌補了人痘苗的不足，并
表達蛋白檢測實驗_點印跡法
實驗方法原理本方案用DNA點跡雜交檢測噬斑以鑒定重組病毒。像點跡雜交一樣，將感染細胞裂解物印跡在硝酸纖維素膜上（可參考「痘苗DNA檢測實驗」中「斑點雜交法」）。用可以識別外源基因表達蛋白的抗體與膜一起孵育，用125I 標記的蛋白 A 檢測結合的抗體，還可應用化學發光檢測系統，如 Amersham E