Nature子刊|香港大學翟元樑團隊DNA復制最新見解

　　在真核生物中，起源識別復合體(ORC)促進了復制前復合體(pre-RC)在起源DNA上的組裝，以獲得復制許可。

2024年9月13日，香港大學翟元樑作為通訊作者在Nature Communications在線發表題為“Replication licensing regulated by a short linear motif within an intrinsically disordered region of origin recognition complex”的研究論文，該研究結果為ORC在G1期支持起源許可及其在S期限制起源激活的調控中的多方面作用提供了重要的見解。

研究酵母Orc2亞基的N端內在無序區(IDR)在這一過程中起著至關重要的作用。從Orc2-IDR中去除一個片段(殘基176-200)或突變一個關鍵的異亮氨酸(194)可顯著抑制整個基因組的復制起始。這些Orc2-IDR突變體能夠組裝ORC-Cdc6-Cdt1-Mcm2-7中間體，該中間體表現出ATP水解受損，無法轉化為后續的Mcm2-7-ORC復合物和pre-RC。這些缺陷可以通過Orc2-IDR肽部分修復。此外，S周期蛋白依賴性激酶磷酸化Orc2-IDR區域，阻斷其與Mcm2-7復合物的結合，導致pre-RC組裝缺陷。

真核生物DNA復制開始于分散在整個基因組中的多個復制起點。為了確保精確的基因組復制，每個起源在每個細胞周期中只被激活一次。這種精確的控制是通過復制前復合體(pre-RC)在起始DNA的G1期組裝實現的，然后在細胞進入S期時激活。在酵母菌中，起源識別復合體(ORC)促進了pre-RC組裝，ORC結合到包含ARS共識序列(ACS)的自主復制序列(ARS)上。ORC由6個亞基組成，Orc1-6。Orc1-5各具有AAA +或AAA +樣結構域和帶翼螺旋結構域(WHD)，而Orc6與其他ORC亞基幾乎沒有相似之處，而是類似于轉錄因子IIB (TFIIB)。這六個亞基，連同Cdc6和Cdt1一起，共同在起源DNA上將Mcm2-7復合體的兩個拷貝組裝成首尾相連的雙六聚體(DH)。這個過程也被稱為復制許可或pre-RC組裝。一旦加載，MCM-DH在整個G1期保持非活性。然而，在進入S期后，Dbf4依賴性激酶(DDK)和S細胞周期蛋白依賴性激酶(S-CDK)與多種起源激發因子協同工作，激活MCM-DH，導致兩個活躍復制體的形成，驅動雙向DNA合成。

酵母復制許可的體外再現為pre-RC組裝過程提供了有價值的見解。它從ORC對起源DNA的識別開始，作為后續組裝事件的平臺。然后，Cdc6被ORC招募，以促進將第一個Cdt1-Mcm2-7七聚體裝載到DNA上的瞬時ORC-Cdc6-Cdt1-Mcm2-7 (OCCM)中間體中。在ATP水解后，OCCM經歷結構重構，轉化為Mcm2-7-ORC (MO)復合物，其中ORC的結合位點從ACS變為下游的B2 DNA元件。MO復合體是指導第二個Cdt1-Mcm2-7七聚體在正確方向上募集的基礎，以與最初裝載的Mcm2-7融合，形成緊密耦合的DH。最近的單分子研究表明，在MO形成過程中，單個ORC可以翻轉負載的Mcm2-7單六聚體以捕獲其下游結合位點。為了完成這一過程，ORC必須在從ACS位點釋放后，在與B2 DNA重新結合之前，與第一個加載的Mcm2-7保持穩定的聯系。Orc6通過其N端結構域(NTD)與Mcm2相互作用，參與了這一過程。然而，OCCM驅動這種轉換的確切機制以及ORC如何完成其翻轉仍然知之甚少。

ORC在起始DNA上的活性受翻譯后修飾的調控。由于CDKs在整個細胞周期中的活動，ORC在復制許可中的功能僅限于G1期。已證實S-CDKs靶向Orc2和Orc6，對ORC有抑制作用。最近的研究表明，ORC的S-CDK磷酸化不會阻止MCM向起源DNA募集。然而，它顯著抑制MO的形成。有趣的是，Orc6磷酸化允許其NTD與ORC-Cdc6復合物相互作用，特別是在與Mcm7的C端WHD共享的表面，減緩OCCM的形成。然而，S-CDK磷酸化Orc2如何阻斷pre-RC組裝的分子細節尚不清楚。

研究闡述了Orc2的N端IDR，并確定了一個對細胞活力至關重要的含有α-螺旋(SH)的短片段(176-200)。進一步的分析表明，通過OCCM調節ATP水解來促進pre-RC組裝，該IDR區域是MO形成所必需的。此外，S-CDK靶向Orc2-SH抑制磷酸化以阻斷復制許可。研究的發現為嵌入在Orc2-IDR中的短線性基序在DNA復制起始調控中的重要作用提供了機制見解。

　　參考消息：

　　https://www.nature.com/articles/s41467-024-52408-0