食用合成色素的測定——薄層層析法

1、原理

聚酰胺是具有二極性的化合物，在酸性條件下與水溶性酸性染料結合，而與天然色素、蛋白質、脂肪、淀粉等物質分離，然后再在堿性條件下解吸色素，再在薄層層析法進行分離鑒別，與標準比較定性、定量（紙層析進行定性，薄層層析進行定量）。

2、操作步驟

食品其形態是千變萬化的，添加在食品中的色素方式亦是各種各樣的，有的拼色加入，有的加在食品的表層幾個色素點，有的覆蓋一層色素, 有的用色素和雞蛋，很形象地作成傳說中的故事、動物、花卉以及象征豐收、延年益壽、節日愉快、生日快樂等附在食品的最顯眼的地方，屬于這類食品的有中式糕點、西式糕點，還有飲料、小食品等色素的測定。樣品不同，處理方法則就不一樣。

⑴ 樣品表面色素的測定

如中式、西式、生日蛋糕、節日壽糕一類，首先將代表性的樣品整體稱重，記錄重量，然后分別取下相同著色部分，進行提取和分離，不要將部分著色樣品和整個或大部分不著色樣品混在一起。如果這樣，分離就困難，而且增加分離誤差，使結果偏差大，例如一塊蛋糕重500g，取下色素部分經測定是50mg，表示500g重的含量即萬分之一。

⑵ 樣品外皮色素的測定

如兒童食品中的糖豆、朱古力豆、紅心果等樣品，只需將外表皮色素用少量的水溶下來（在用水溶解之前，先稱重量并記錄），并定容一定體積（將沒有色素的樣品棄去），供檢驗用，其計算與上面一樣。

⑶ 非酒精性飲料中色素的測定（各種汽水、桔子汁等）

(1) 吸附

吸50ml樣→與燒杯中→在電爐上加熱至沸→不斷攪拌除CO2→加1g聚酰胺粉（60℃活化1小時）→充分攪拌→使色素完全被聚酰胺粉吸附→用布氏漏斗過濾→用80℃熱水20ml洗沉淀物→用甲醇-甲酸（6︰4）20ml再洗沉淀物（除天然色素）→直到濾下來溶液無色→再用80℃熱水150ml分次洗沉淀物。

(2) 解吸

在不抽濾條件下，將9︰1乙醇氨液加在沉淀物中使吸附在聚酰胺粉上的色素全部解脫下來，收集于蒸發器中，水浴中濃液到5ml左右，加3滴20%檸檬酸溶液（使色素穩定），定容10ml，供薄層點樣用。

(3) 注意事項

樣品在加入聚酰胺粉之前，要用20%的檸檬酸調節pH=4（聚酰胺粉末在弱酸性溶液中對色素吸附力強，吸附亦完全）。

如果樣品不含天然色素，除CO2后直接加聚酰胺吸附。

⑷ 對各種糖果色素的測定

1) 樣品處理

a.      硬糖（不含蛋白質、淀粉）粉碎→稱樣3g→加50ml水溶解→再加30%檸檬酸3滴調pH=4

b.     軟糖（含淀粉高果飴）除外層冰糖屑→切碎→加50ml熱水溶解→用20%檸檬酸調pH=4→加淀粉酶1ml（消化淀粉）→90℃水浴15分鐘→溶液中出現沉淀物直到變清

c.     奶糖→加9︰1乙醇氨溶液溶解→用1︰10H2SO4調pH→加1%鎢酸鈉使蛋白質沉淀，奶脂凝集沉淀→布氏漏斗抽濾

2) 吸附色素

1g聚酰胺粉+糖液→70℃水浴→攪拌使之充分吸附→用布氏漏斗抽濾→用80℃水洗漏斗上的沉淀物→再用丙酮洗（除油脂，硬糖不必）→再用80℃水洗沉淀物→洗到pH與原水相同

3) 解吸色素

沉淀物用乙醇氨解吸液全部解吸→收集于蒸發皿中→水浴濃液到4ml→加20%檸檬酸3滴→用水定容10ml→留做點樣用（單一色素直接比色，拼色要分離，先定性后定量）

⑸ 肉和肉制品中色素的測定

1) 前處理

稱處理樣→加海砂3g和20ml丙酮→于研缽中一起研→除去脂肪和水分→除去丙酮

2) 解吸樣液中的色素

將上面沉淀物放入布氏漏斗→用解吸液從肉蛋白中使色素全部解吸下來→加熱到70℃→用1︰10H2SO4調PH再加1ml10%鎢酸鈉→使蛋白質全部凝聚沉淀→用布氏漏斗抽濾→用70℃水20ml洗漏斗→收集全部濾液

3) 吸附樣液中的色素

稱1g聚酰胺粉+上面的濾液→攪拌→抽濾→用水洗漏斗中沉淀物→直到濾水與原水PH相同

4) 解吸樣液中色素（與非酒精性飲料相同）

⑹ 果脯類色素的測定

1) 處理

取樣研碎后稱2g→加50ml水→加熱70℃使溶解

2) 吸附

吸附劑1g+上述液→抽濾→用70℃熱水洗沉淀物

3) 除天然色素

用甲醇-甲酸（6︰4）混合液解吸天然色素→直到濾液無色為止→再加甲醇10ml進一步除天然色素→70℃熱水洗，不斷攪拌

4) 解吸

用解吸液解吸樣品沉淀物中全部人工合成色素→濃液解吸液（甲醇、氨）直到無甲醇、氨時→用1︰10H2SO4調pH=4→再按上述加吸附劑操作重復1-2次，把天然色素全部去凈為止，最后解吸、定容同上。

⑺ 各種加工蔬菜中色素的測定

這一類色素測定按理論應該以蜜餞的操作來處理，但在實驗中這些樣品膠體過多，使解吸、過濾等操作非常困難，所以我們應該按下述方法進行：取樣20g（干菜2g），加入100ml 80%的乙醇溶液，浸泡2小時，再以含有1%氨水的70%乙醇反復浸出，合并浸出液，直到色素全部被洗脫下來，置70-80℃水浴上，將全部浸出液濃縮，待氨全部逸出去（沒有氨味），調pH=4，加1g聚酰胺吸附，然后用布氏漏斗過濾，以200ml 70-80℃水洗滌漏斗的聚酰胺粉，然后用甲醇-甲酸洗脫天然色素。以上操作同蜜餞中色素的測定方法。

⑻ 提純色素溶液的紙層析定性

為了判斷樣品中存在有幾種色素以及是什么色素，必須進行紙層析進行鑒定。

經濃縮后樣品色素溶液→于新華中速層析濾紙上點樣→點樣量3-5微升（若樣品含量低可取出1ml在濃縮至0.2ml再點樣）→點樣點的直徑應不超過2毫米為宜→點樣線距底邊2厘米→樣點間距離以及左右紙邊各距2厘米→用展開劑展開→測量各色素點的Rf值→于標準色素Rf值對照→確定何種色素（以標準色素斑點Rf值衡量樣品各色素斑點的Rf值是否于標準點在同一條直線上，色素的顏色是否完全一致，就可確定樣品色素屬于何種色素）。                       

Rf（比移值）=斑點移動距離/溶劑前沿距離                        

所使用的展開劑有：

1)正丁醇︰無水乙醇︰1%氨水 = 6︰2︰3

2)正丁醇︰吡啶︰1%氨水 = 6︰3︰4

3)異丁醇︰無水乙醇︰水 = 3︰2︰2

⑼ 提純色素溶液的薄層分離和定量

經過紙層析定性之后，含有一種色素的樣液定容之后，離心即可定量；含有兩種以上的復合色素的樣品溶液，需要經過薄層分離為單色素后，再用比色法分別定量，測定出各種色素的含量。

具體步驟是：薄層板制板→點樣層析→比色→標準曲線繪制→計算含量

1) 薄層板制備

聚酰胺粉1g于研缽中→加15ml 75%甲酸→攪拌，使聚酰胺全部溶解→加7.5g硅膠G→研磨1分鐘→立即涂板（玻璃板要求光滑平整，先用水洗凈，干燥后用酒精擦拭干凈，涂板時可用涂本器或手工玻璃涂布）→可涂15×10厘米玻璃板三塊（厚度為0.25-0.3毫米）→玻璃板放入盛有少量水的大玻璃缸中→蓋好蓋子→使玻璃板中的甲酸由缸底的水吸取→放2-3小時→取出玻璃板→于空氣中風干→于60-65℃烘箱30分鐘→放入干燥器中備用

2) 點樣層析

用點樣管（毛細管、微量注射器）將濃縮并定容的樣液點在薄層板上→基線距底邊2厘米→點成與底邊平行的條狀→兩端距邊各為2厘米，點樣量一般為0.4ml→點樣時要用電吹風機邊點邊吹干→然后進行展層析

展層缸先用溶劑系流30分鐘→再把點好樣的薄層板放入展析缸用上行法展開→薄板下端浸入溶液0.5-1厘米→大約1小時看色素已明顯分開后→即可取出薄板→晾干

對溶劑系流的選擇是：a) 分離胭脂紅、莧菜紅、新紅、檸檬黃、桔黃、靛藍等用正丁醇︰吡啶︰5%氨水=6︰6︰4（這種展開劑主要分離靛藍，因為靛藍上升很快，其它上升很慢）；b) 分離檸檬黃、胭脂紅、莧菜紅、檸檬黃、桔黃等時用展開劑為2.5%檸檬酸鈉︰氨水=4︰3（檸檬黃上升很快，其它上升慢）；c) 對于分離兩種紅色素（莧菜紅、胭脂紅）的食品用甲醇︰乙二胺︰氨水=10︰3︰4（主要是莧菜紅與胭脂紅上升快，其它色素上升慢）。

3) 比色定量

將薄層板展開后→用小刀分別將各條色斑刮下→移入砂芯漏斗→用乙醇氨溶液解吸抽濾→于水浴上蒸發到無氨味→定容10ml→分別測出消光值E（根據各種色素的最大吸收波長測定其光密度）→從標準曲線上查出相應的各色素含量.

4) 標準曲線的制備

先配成標準色素貯備液（100微克/ml），稱0.1g標準色素加水稀釋至1000ml

10ml比色管 0   1     2     3     4    5     6     7    8    9

標準應用液 0  0.1  0.5  1.0  2.0  3.0  4.0  5.0  6.0 7.0

加水                     分別加水至10ml

相當于μg/ml 0  1    5    10   20   30   40   50   60   70

分別測出EO-E9的消光值以水為參比，以色素濃度為橫生標，消光值為縱坐標，繪制標準曲線。以水為參比，pH值為6，各色素的最大吸收波長為下：

胭脂紅 508納米；檸檬黃 428納米；莧菜紅 520納米；

晚霞黃 485納米；赤蘚紅 528納米；靛藍  610納米；