定量PCR常見問題及對策

Q1．無CT值（信號）出現
A1．1.反應循環數不夠。一般都要在35個循環以上，可根據實驗情況增加循環（如至45cycles），但高于45個循環會增加過多的背景信號。
2.檢測熒光信號的步驟有誤。一般SG法采用72℃延伸時采集，Taqman法則一般在退火結束時或延伸結束采集信號。
3.引物或探針降解。可通過PAGE電泳檢測其完整性。
4.引物或探針的設計，如探針高于引物的溫度不夠，造成探針未雜交上而產物已延伸的情況。
5.模板量不足。對未知濃度的樣品應從系列稀釋樣本的最高濃度做起。
6.模板降解。避免樣品制備中雜質的引入及反復凍融的情況。

Q2．CT值出現過晚
A2.1.擴增效率低，反應條件不夠優化。設計更好的引物或探針；改用三步法進行反應；適當降低退火溫度；增加鎂離子濃度等。
2.PCR各種反應成分的降解或加樣量的不足。
3.PCR產物太長。一般采用80-150bp的產物長度。

Q3．標準曲線的線性關系不佳
A3.1.加樣存在誤差，使得標準品不呈梯度。
2.標準品出現降解。應避免標準品反復凍融，或重新制備并稀釋標準品。
3.引物或探針不佳。重新設計更好的引物和探針
4．模板中存在抑制物，或模板濃度過高

Q4．陰性對照也出現明顯的起飛
A4．1.應mix或水被污染。
2.引物二聚體的出現。用SG法在35cycles以后陰性出現起飛屬正常情況，可配合熔解曲線進行分析。
3.反應過程中探針的降解。用PAGE電泳對探針進行檢測。
4.如果使用了ROX校正，則可能是ROX的降解所造成。

Q5．在溶解曲線前是否插入一個同溶解程序初始溫度相同的一個保溫過程
A5．如果在熔解曲線前沒有一個保溫過程，則曲線會在前幾個循環非常陡峭，使真正的熔解峰型幾乎看不到。

Q6．熔解曲線不止一個主峰
A6．1．引物設計不夠優化。應避免引物二聚體和發夾結構的出現。
2.引物濃度不佳。適當降低引物的濃度，并注意上下游引物的濃度配比。
3.鎂離子濃度過高。適當降低鎂離子濃度，或選擇更合適的mix試劑盒。
4.模板有基因組的污染。RNA提取過程中避免DNA的引入，或通過引物設計避免非特異擴增。

Q7．擴增效率低
A7．1.反應試劑中部分成分特別是熒光染料降解。
2.反應條件不夠優化，可適當降低退火溫度或改為三步擴增法。
3.反應體系中有PCR反應抑制物。一般是加入模板時所引入，應先把模板適度稀釋，再加入反應體系中，減少抑制物的影響。

Q8．實驗重復性不好
A8．1.加樣不準確。
2.儀器在樣品上溫度條件有差異，即溫度均一性不好。
3.模板濃度低。樣品初始濃度越低，重復性越差，應減少樣品的稀釋倍數。

Q9．變性溫度是否合適
A9．大部分的雙鏈DNA在95°C就開始解鏈了，在有些情況下在90至94°C都不能很好地變性DNA。由于部分變性，參加反應的探針和引物相應的減少了，因此反應效率會下降。

Q10．變性時間是否合適
A10．15到20秒對于變性擴增子是足夠了，然而，長一點的產物，可能會需要30秒，60秒的變性時間通常是不需要的。

Q11．退火溫度和時間是否合適
A11．檢查引物和探針的Tm值，SYBRGreenI的退火時間大約20到35秒，雙標記探針通常是兩步法，退火和延伸合并為一步，時間大約是45到60秒，溫度通常在60°C，對于FRET探針退火步驟大約20到30秒。

Q12．在哪一步驟采集信號
A12．SYBRGreenI應當在72°C，此時絕大部分的DNA是雙鏈狀態，如上所述，雙標記探針通常是兩步檢測，因此信號采集應該在退火延伸的整合步驟。對于FRET檢測，數據應該在退火步驟檢測。如果對于信號采集點不確定，可以多點采集作對比。如果監控屏幕檢測不到信號，檢查程序設定是否存在至少一個的信號采集點。

Q13．是否選定了合適的增益值
A13．一些情況下會看到曲線超過了窗口范圍，在熒光強度100的地方成一直線。盡管大部分的數據可以用，但是減少增益，一些原始數據就不會超出范圍。有時，在第一個循環信號就跳出了窗口范圍，這是由于增益選得太高，看起來像沒有檢測到數據。如果熔解曲線分析時，開始熒光就達到了100，則應當用低的增益重新運行，而不需要重新運行擴增反應，SYBRGreenI和FRET的樣品可以在一定程度上反復使用