mESCs體外EBs分化鑒定

實驗概要

mESCs體外EBs分化鑒定

主要試劑

0.25%Trypsin，細胞基礎培養液

實驗材料

60 mm、100 mm培養皿、15 mL離心管、50 mL離心管、倒置顯微鏡

實驗步驟

（1）常規方法消化細胞（參見胚胎干細胞傳代方法），吹打成單細胞。
（2）將單細胞移至60 mm或100 mm培養皿中，改用細胞基礎培養液培養（每個60 mm培養皿加5 mL培養液）。
（3）將培養皿放入培養箱培養，每天取出1～2次，輕輕晃動或用粗口滴管吹打，使細胞懸浮，各團分開，并逐日觀察。
（4）一般培養至第3天，細胞團開始分層，外部是一層較大的內胚層樣細胞，內部的細胞則小而緊密，為外胚層樣細胞和干細胞，此為簡單類胚；再培養5～10天，分層增多，并出現空腔，整個胚呈圓泡狀，此為囊狀胚。
（5）收集囊狀胚，提取mRNA，反轉錄為cDNA，然后使用三胚層基因的引物進行PCR來檢測三胚層的基因的表達情況，從而確定囊狀胚中是否有三胚層的分化，這樣可以確定細胞是否具有在體外分化為三胚層細胞的能力。