所有合成cDNA第一條鏈的方法都要用依賴于RNA的DNA聚合酶(反轉錄酶)來催化反應，主要有兩個關鍵因素，一個是mRNA模板，另一個是反轉錄酶 。商品化反轉錄酶有從禽類成髓細胞瘤病毒純化到的禽類成髓細胞病毒（AMV）逆轉錄酶和從表達克隆化的Moloney鼠白血病病毒反轉錄酶基因的大腸桿菌中分離到的鼠白血病病毒（MLV）反轉錄酶。AMV反轉錄酶包括2個具有若干種酶活性的多肽亞基，這些活性包括依賴于RNA的DNA合成，依賴于DNA的DNA合成以及對DNA-RNA雜交體的RNA部分進行內切降解（RNA酶H活性）。
MLV反轉錄酶只有單個多肽亞基，兼備依賴于RNA和依賴于DNA的DNA合成活性，但降解DNA—RNA雜交體中的RNA的能力較弱。且其熱穩定性較AMV反轉錄酶差。MLV反轉錄酶能合成較長的eDNA（如大于2～3kb）。
AMV反轉錄酶和MI。V反轉錄酶利用RNA模板合成cDNA時的最適pH、最適鹽濃度和最適溫度各不相同．所以合成第一鏈時相應調整條件是非常重要的。
AMV反轉錄酶和MLV反轉錄酶都必須有引物來起始DNA的合成。cDNA合成最常用的引物是與真核細胞mRNA分子3’端poly（A）結合的12～18個核苷酸長的oligo（dT）。