T細胞增殖分析的人氣之選

　　對免疫學家而言，細胞增殖通常是T細胞受刺激的反映。受到刺激的T細胞產生它們自己的克隆副本，時刻警惕著特定抗原的再次來襲。

　　對于細胞增殖的分析，目前一般分為兩大陣營。在第一個陣營中，研究人員依賴某些試劑來區分靜止和分裂的細胞。這些試劑包括核苷類似物(如BrdU)、DNA染料(Hoechst和PI)，和細胞周期調控蛋白(如Ki-67)的抗體。有時，它們也能確定細胞周期的階段。

　　第二大陣營則更直接地表明細胞自標記起共分裂了多少代。在此，細胞被標記上永久連接的染料。當細胞分裂時，染料也隨之分裂，信號強度減半，這樣就能了解細胞分裂了多少代。不過最多就6-8代，之后，信號通常太暗淡，難以與自發熒光區分開。下面就讓我們來看看這些分析的優勢與不足。

　　流式來幫忙

　　在流式細胞分析中，熒光標記的細胞排隊通過流式細胞儀。儀器激發熒光基團，并定量特定波長下的熒光。熒光基團可由細胞的DNA編碼(如GFP)，也可與抗體結合，或與特定的細胞組分發生反應。

　　流式分析不僅能讓細胞被一一分析，“這也是一種非常強大的技術，讓我們能一次測定許多不同的性質，”Robert Balderas談道。他是BD生命科學部門負責流式細胞儀開發的副總裁。“作為一個平臺，它讓我們能查看細胞的大小和粒度，細胞上有什么，細胞內有什么。”

　　Balderas認為，更重要的是，流式細胞分析給了我們一個大海撈針的機會。研究人員可以利用此技術發現異質群體中獨特的細胞類型，例如對分化標志物染色，對細胞表面活化標志物染色。此類免疫分型不僅能夠區分Th1、Th2和Treg細胞，還能確定每個亞群的標志物有何不同。

　　染料選擇多

　　據Roswell Park癌癥研究所的腫瘤學教授Paul Wallace介紹，追蹤T細胞增殖的常用方法是將熒光基團與細胞內的蛋白質相連接(蛋白質染料)或讓熒光基團插入細胞膜中(細胞膜染料)。

　　蛋白質染料的代表是羧基熒光素二乙酸鹽琥珀酰亞胺酯(CFDA-SE)，這是一種不帶電荷的染料，很容易穿過細胞膜。一旦進入細胞，CFDA-SE被內源性的酯酶裂解，產生反應性的醛基，不加選擇地與蛋白質上的氨基結合，從而標記蛋白質。在藍光的激發下，CFDA-SE發出綠色熒光。不過，最近也有一些類似的蛋白質染料被開發出，它們有著不同的光譜特性，可以與CFDA-SE可能干擾的熒光試劑配合使用。

　　CFDA-SE標記細胞的熒光非常穩定和均勻，細胞每分裂一次，熒光強度就減弱一半，這樣通過流式細胞儀檢測就能檢測出沒有分裂的細胞。整個標記過程也相當簡單。由于化合物只與蛋白質的一小部分相互作用，故它對細胞功能的影響似乎不大。不過愛因斯坦醫學院的 Steven Porcelli教授也指出，可能還是有一定的影響。因此他建議優化CFDA-SE的濃度。

　　細胞膜染料的代表是Sigma-Aldrich的PKH系列，但其他制造商也提供具有不同光譜特性的版本。對于PKH系列染料，極性的熒光頭部基團與長長的碳氫尾部相連，讓染料能迅速插入脂雙層，并穩定但非共價地保留在細胞內。目前較為常用的是PKH2和 PKH67(綠色)和PKH26(紅色)。

　　細胞膜染料似乎對細胞功能沒有影響，因此能獲得非常明亮的細胞。Wallace指出，它們是親脂性的，只是想進入膜。這些染料也可用于動力學研究，而不像蛋白質染料，需要一天才能穩定。不過，這個過程也挺麻煩，如果做不好，會導致細胞染色不均勻。 Wallace建議多實踐幾次。

　　體內 vs. 體外

　　細胞在體外染色之后，可刺激并體外培養，也可轉移到動物宿主內，進行體內研究。然而，康涅狄格大學健康中心的助理教授Evan Jellison認為，并非所有研究都適合從動物中取出細胞，標記后再重新引入活體動物中。

　　在這種情況下，細胞必須在體內標記。研究人員通常摻入BrdU，通過注射或加入飲用水中，以確定細胞在pulse過程中是否復制了其DNA。不過，若要通過流式細胞儀來觀察BrdU，首先必須透化細胞和核膜，然后變性并以熒光標記的BrdU抗體來檢測DNA。

　　現在，研究人員還有一個選擇，那就是Life Technologies的Click-iT? Plus EdU Alexa Fluor? 647 Flow Cytometry Assay Kit。他們可用胸苷類似物EdU注射動物，然后收集細胞，進行檢測。EdU的檢測是基于一個click反應 – 銅催化的疊氮化物與炔烴之間的共價反應。EdU中含有炔烴，而熒光檢測試劑含有疊氮化物。據介紹，這種檢測試劑非常小，比一般的抗體小100倍，因此不需要變性DNA，讓整個過程更快、更簡單。

　　當然，其他的方法也能確定T細胞是否對刺激有反應，如通過血球計數器對細胞進行計數，或測定3HdT的攝入，這些也是可靠的體外方法。然而，多參數的流式細胞分析不僅能夠讓我們確定細胞在受到刺激后是否增殖，還能了解哪些細胞增殖，它們經歷了哪些變化。熒光試劑的饕餮盛宴讓增殖分析既強大、又細致。