SEM特殊樣品的制備技術，你知道嗎？

　　一、直接觀察法

　　1.基本描述:樣品不經過任何處理,直接粘貼到樣品托上入鏡觀察

　　2.適用范圍:適合于低倍條件下, 觀察含水量少的、表面有一定導電能力的、對分辨率要求不高的樣品.

　　3.基本步驟:取材→風洗水洗后風干或不洗→粘樣→常壓或低壓觀察

　　4.適用樣品: 植物干標本,干種籽,干果、果殼,竹木、骨骼、牙齒、蛋殼、土壤、巖石、金屬等

　　二、活體觀察法

　　1. 基本描述：

　　利用樣品本身具有的導電和產生二次電子的能力，直接觀察一些體積較小、含水分不多的活體昆蟲或新鮮組織、器官的方法。其特點是：可觀察生物活體形態結構和生活狀態，圖像表現真實，沒有變形或人為附加結構。

　　2. 基本要求：

　　⑴ 限制昆蟲的爬行和跳躍，用膠帶限制其活動。

　　⑵ 樣品體積盡可能小；

　　⑶ 低壓觀察常用2－5Kv，最大10Kv；

　　⑷ 操作熟練，迅速觀察盡早攝影

　　3. 基本步驟：

　　取材→清洗或不洗→膠帶粘樣→常壓或低壓觀察

　　4. 適用樣品：

　　螟、蛾、蚊、蟻、蜂、螨、線蟲、被粘牢固的昆蟲或其器官

　　三、粘貼鍍膜觀察法

　　1. 基本描述：

　　 樣品只進行粘貼、鍍膜即可。

　　 其特點：常壓觀察下獲得高分辨率高放大倍數圖像。

　　2. 適用范圍:

　　 適宜 觀察表面細微結構豐富、含水量少的、形態比較固定或不宜進行脫水或干燥的樣品。本方法解決了樣品的導電率及二次電子發射量的問題，可以常壓下觀察高倍率、高分辨率圖像

　　3. 基本步驟：

　　 取材→粘樣→鍍碳（樣品表面凹凸變化大的可先噴鍍碳層）→金屬膜 →常壓觀察

　　4. 適用樣品:

　　 成熟的孢子、花粉，生活狀態的菌體、菌落，塵埃、微小顆粒，絲絨、毛發，表面凹凸變化大的樣品，如昆蟲體表等。

　　四、熏蒸固定觀察法

　　1. 基本描述：

　　粘貼后的樣品放置于密閉容器中，用熏蒸法進行固定，經鍍膜或不鍍膜即可觀察。其特點：該方法適合“不宜在液體中處理樣品”，蒸汽固定劑為1％－2％的鋨酸，全部操作在通風櫥進行，高倍觀察時還應離子濺射鍍膜。

　　2. 基本步驟:

　　取材→粘樣→熏蒸固定(10-30min)→鍍膜或不鍍膜→常壓或低壓觀察

　　3. 適用樣品: 固定培養基上的培養物，用于研究培養細胞的生長繁殖過程，菌落的自然狀態、菌絲的生長，孢子的形成等。

　　五、石蠟組織切片觀察法

　　1. 基本描述：

　　對動植物的石蠟切片進行適當處理，放在SEM下觀察。其特點：圖像分辨率高、景深大立體感強，制樣簡單、成本低、時間短。

　　2. 基本步驟：

　　光鏡定位→切片→貼臺→脫蠟(二甲苯,3-5min后濾紙吸附溶解物，反復3-5次)→鍍膜(或不鍍膜)→觀察

　　3. 適用樣品：

　　一切組織的石蠟切片都適用，但對已經封固或加蓋片的不能用。

　　六、樣品的割斷

　　（一） 樹脂割斷法

　　1. 環氧樹脂冷凍割斷法：

　　取材修樣(1＊1＊5mm) →固定脫水→包埋置換→固化→割斷樣品→脫樹脂→臨界點干燥→裝臺粘膠

　　2. 苯乙烯樹脂割斷法

　　⑴ 特點:

　　a.包埋的樹脂已聚合,可長期保存

　　 b.割斷時在室溫下進行

　　 c.易割斷較硬的組織(骨骼,結締組織)

　　⑵ 步驟：

　　取材固定脫水→置換→包埋→聚合→割斷→脫樹脂→醋酸異戊酯置換→臨界點干燥→裝臺粘膠

　　(二) 有機溶媒割斷法

　　1. 無水乙醇冷凍割斷法:

　　優點:制作時間短,不易弄臟容器

　　 步驟:取材固定脫水→100%乙醇包埋→冰凍固化→冷凍裂斷→融化乙醇→臨界點干燥→裝臺粘膠

　　2. 70%乙醇冷凍干燥

　　 特點:經濟簡單,但不能人為確定斷裂面

　　步驟:準備→冷凍→自然斷裂→冷凍干燥→裝臺→噴金

　　(三) 干燥樣品的割斷

　　方法:

　　 (1)刀切

　　 (2)鑷子掰開

　　 (3)雙面膠帶法

　　 (4)液氮冷凍割斷

　　七、蝕刻法

　　1. 酶蝕刻法

　　 利用酶的作用使細胞的一部分物質被蝕刻去掉, 從而清楚的顯示出另外一部分結構。

　　如：利用鏈霉蛋白酶(prorase)處理小麥的胚乳細胞，把包在外面的細胞去掉，以觀察淀粉的結構。

　　2.離子蝕刻法

　　使用離子濺射儀進行輝光放電時，用高速的陽離子沖擊樣品表面，剝離掉樣品的成分，暴露樣品內部細微結構。

　　如：用該方法可以看到白細胞、胰臟外分泌細胞的核表面結構，清楚看到核孔的分布狀況。

　　八、鑄型技術

　　1. 概念：

　　為了研究空腔臟器特別是血管系統復雜的立體分布，先向腔內注射某種成形物質，待該物硬化后再把組織腐蝕去掉，剩下的成形物即能顯示血管系統的立體分布，這種技術稱鑄型技術。

　　2. 常用的鑄型劑：

　　甲基丙烯酸酯、聚苯乙烯及其共聚物以及ABS等。ABS是一種樹脂，為丙烯晴、丁二烯和苯乙烯的三元共聚物，是理想的鑄型劑。

　　3. 用ABS制作血管鑄型樣品的一般步驟

　　⑴ 灌流和注入鑄型劑

　　⑵ 腐蝕和清洗

　　⑶ 顯微解剖和剝制鑄型

　　⑷ 干燥和鍍膜

　　九、環氧樹脂包埋的樣品SEM觀察法

　　1. 基本描述：

　　環氧樹脂包埋的樣品切成半薄切片或超薄切片后，再將環氧樹脂除去，在SEM下觀察研究，可以對樣品的細胞結構進行多種綜合研究，得到更多的信息。

　　2.常用溶劑：

　　氫氧化鈉飽和乙醇（或醚類、丙酮）容易可以溶解已經聚合的環氧樹脂，將NaOH溶解于乙醇，飽和（2％－4％），放置2－3天，在此過程中產生氧自由基，溶液顏色由淺褐色變成金棕色，氧自由基可以打斷環氧樹脂和酸酐間的酯連接，溶解環氧樹脂。也可用NaOH的冠醚溶液。

　　3.操作步驟：

　　⑴ 解剖鏡下除去環氧樹脂中不感興趣的部分。

　　⑵ 將組織塊（或切片）放入合適的容器中，其中加入溶解液NaOH的乙醇溶液5－10ml,1-4h

　　⑶ 樣品取出放入絕對乙醇(或冠醚)中徹底清洗組織

　　⑷ 臨界點干燥

　　⑸ 粘膠鍍金屬膜并觀察。