在構建雙鏈RNA的表達載體時，使用RNA多聚酶Ⅲ來指導RNA的合成。這是因為RNA多聚酶Ⅲ有明確的啟始和終止序列，而且合成出的RNA不會帶有polyA尾。當RNA多聚酶Ⅲ遇到連續5個胸腺嘧啶時，它指導的轉錄就會終止，并且轉錄產物在第二個尿嘧啶處被切下來。U6啟動子能被RNA多聚酶Ⅲ識別，
合成出RNA。ShiYang[10]等人用Bluescript作為載體，U6作為啟動子，從綠色熒光蛋白（GFP）的基因上選擇了一個21個核苷酸的片斷（片斷1），將其插入到Bluescript載體中。然后合成出片斷1的反向重復序列，并在其后加了5個胸腺嘧啶，稱為片斷2。他們將片斷2接到
Bluescript載體中片斷1的后面，將載體轉移到細胞中后，轉錄出的RNA由于具有回文序列，會形成一個發卡樣結構，從而得到了雙鏈RNA。片斷后面加了5個胸腺嘧啶，RNA轉錄到這個位置時就會終止。而且轉錄出的RNA形成發卡樣結構后，會在3’端形成2個突出的尿嘧啶，這類似于天然的
siRNA,因而有利于雙鏈RNA誘發RNAi。
RNA多聚酶Ⅲ還能識別H1-RNA 啟動子。在H1-RNA 啟動子后面接上能形成發卡樣結構的反向互補序列，將此載體轉入細胞后也能在細胞內合成dsRNA[9]。
T7也可作為啟動子合成dsRNA。將PCR產物用NotI酶切后自身連結，回收正向片斷和反向片斷連結形成的具有反轉重復序列的片斷，接到pGEMTeasy載體上，就構建成了可以表達dsRNA的載體。用此載體可先在體外合成dsRNA,或將其轉入到細胞內合成dsRNA。在后一種情況下，還須將能表達T7RNA多聚酶的載體也一起轉入到細胞中，以提供能識別T7啟動子的RNA多聚酶[11]。
雙鏈RNA只能短暫抑制哺乳動物細胞的基因表達。而具有發卡結構的雙鏈RNA能夠增加阻斷基因表達的時間。在小鼠畸胎瘤細胞，胚胎干細胞，C2C12細胞中，用長鏈具有發卡結構的雙鏈RNA有效的阻斷了報告基因的表達，在穩定表達具有發卡結構的雙鏈RNA
的細胞株中，報告基因的表達被長期的阻斷了[12]。
腺病毒是體內轉基因的常用載體。Xia HaiBin等用腺病毒做載體，在體內和體外表達dsRNA,并成功的阻斷了基因的表達，從而實現了成體動物的基因敲處[13]。
四. RNAi的應用
1. 高通量的研究基因功能
在后基因組時代，需要大規模高通量的研究基因的功能，由于RNAi能高效特異的阻斷基因的表達，因而RNAi成為研究基因功能的很好的工具。研究者將線蟲三號染色體上2232個基因對應的dsRNA合成出來，并注射到線蟲性腺內，然后觀察子代細胞分裂時出現的異常表型，結果發現了133個基因與細胞分裂異常有關。其中104個基因以前沒有發現有這種功能。在另外一項研究中，線蟲一號染色體上的2416個基因對應的dsRNA被構建到細菌文庫中，然后將細菌喂給線蟲，觀察形態學的異常，異常的運動，性別比例的變化，不孕的情況，結果將于這些表型有關的基因從70個增加到178個。
2. 基因敲除
在線蟲的體內外試驗中，RNAi都能達到基因敲除的結果，從而成為研究這些基因功能的良好工具。對于哺乳動物，RNAi能在體外培養的細胞達到基因敲除的效果，對于一些敲除后小鼠在胚胎時就會死亡的基因，可以在體外培養的細胞中利用RNAi技術研究它的功能。由于RNAi能高效特異的阻斷基因的表達，它成為研究信號傳導通路的良好工具。在線蟲體內，胰島素和受體結合后可以活化DSOR1,它是MEK的類似物，DSOR1活化后可以激活ERKA,它是ERK的類似物。用以DSOR1為靶目標的dsRNA可以阻斷DSOR1的表達，雖然總的ERKA的表達不受影響，但由于DSOR1的表達被抑制，因而胰島素刺激后ERKA不能活化。RNAi還被用來研究在發育過程中起作用的基因，如可用RNAi來阻斷某些基因的表達，來研究他們是否在胚胎干細胞的增殖和分化過程中其起著關鍵作用。
3. 基因治療
目前抑制基因表達常采用反義技術或轉入沒有功能的突變體與該基因競爭。這兩種方法對基因表達的抑制都不如RNAi高效特異持久。作為基因治療的工具，RNAi既高效特異，又簡便易行。RNAi在某個基因表達異常增高引起的疾病中會非常有用，如病毒感染，腫瘤等。CDK-2是調控細胞周期的一個關鍵基因，用以CDK-2位靶目標的dsRNA能阻斷99.7%的細胞中CDK-2的表達，而在對照中只有0.2%
的細胞中CDK-2基因的表達降低[10]。因而，以CDK-2位靶目標的dsRNA能治療細胞異常增殖相關的疾病，如腫瘤等。DsRNA還可以抗病毒治療。研究者們將HIV-1編碼rev的基因和與它同源的雙鏈RNA共轉染到293細胞中，rev基因的表達被顯著抑制[14]。CD4基因編碼細胞表面
HIV病毒的受體，用針對CD4的dsRNA能將細胞表面HIV病毒的受體表達減少75%，從而抵抗HIV病毒的感染。
4. 基因表達調控
今年研究者發現RNAi在Epigenetics中發揮重要作用。Epigenetics是指至少一代的基因表達的改變，而基因的編碼沒有改變。今年研究者發現，epigenetics調控的一種類型是染色體的改變。通過改變染色體的形狀（更緊或是更松），能夠決定那一個基因表達。但什么促進了染色體形狀的改變以前并不清楚。今年研究者發現，siRNA在染色體形狀的改變中起著非常重要的作用。這樣
RNAi能永久的關閉基因的表達，而不僅僅是短期的抑制它。通過在發育過程中關閉或開放基因的表達，siRNA可能指導著細胞的定向分化。RNAi已被證實能引導植物干細胞的分化，因而研究者認為RNAi也可能參與指導人的干細胞的分化。由于RNAi在基因表達調控中發揮重要的作用，對RNAi微小的干擾就可能導致腫瘤的發生。
目前RNAi在非脊椎動物如線蟲，果蠅，以及植物中的應用已經取得了很多重要的成果，但在哺乳動物中的應用還處于起步階段。在哺乳動物細胞中，RNAi并不能完全阻斷基因的表達，特別是表達異常高的基因。Tuschl等人的研究工作中，有三個基因被抑制了
90%，但有一個基因沒有被抑制，這就是一個表達很高的基因。另外，運載體系一直是體內基因治療的瓶頸，如何將雙鏈RNA高效特異的轉入體內仍是一個難題。目前已能用腺病毒作為載體在體內實現RNAi,但仍需要尋找更為安全有效的載體。