病毒基因、人工轉入基因、轉座子等外源性基因隨機整合到宿主細胞基因組內，并利用宿主細胞進行轉錄時，常產生一些dsRNA。宿主細胞對這些dsRNA迅即產生反應，其胞質中的核酸內切酶Dicer將dsRNA切割成多個具有特定長度和結構的小片段RNA（大約21～23 bp），即siRNA。
siRNA在細胞內RNA解旋酶的作用下解鏈成正義鏈和反義鏈，繼之由反義siRNA再與體內一些酶（包括內切酶、外切酶、解旋酶等）結合形成RNA誘導的沉默復合物（RNA-induced silencing complex，RISC）。
RISC與外源性基因表達的mRNA的同源區進行特異性結合，RISC具有核酸酶的功能，在結合部位切割mRNA，切割位點即是與siRNA中反義鏈互補結合的兩端。
被切割后的斷裂mRNA隨即降解，從而誘發宿主細胞針對這些mRNA的降解反應。
siRNA不僅能引導RISC切割同源單鏈mRNA，而且可作為引物與靶RNA結合并在RNA聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase，RdRP）作用下合成更多新的dsRNA，新合成的dsRNA再由Dicer切割產生大量的次級siRNA，從而使RNAi的作用進一步放大，最終將靶mRNA完全降解。