PCR產物定量實驗

DNA 標準 TE PCR 產物

熒光計 金屬箔紙 微量離心管

方法 A: 熒光測定法

熒光測定法可以在納克級范圍精確定量。熒光計和 DNA 定量試劑盒許多公司都有出售。確定熒光計是否安裝了適合于特定染料的激發和發射的部件至關重要。該方法在設計上適用于配有帶藍色 LED 光源的濾光設備、微池附加器、試管（TurnerDesigns) 和 PicoGreen dsDNA Quantitation 試劑盒（Molecular Probes) 的微型焚光計。

一、材料

1. 緩沖液和溶液

LambdaDNA 標準（100ug/ml)

TE(10 mmol/LTris-HCl,lmmol/LEDTA,pH7.5)

2. 核酸和寡核苷酸

純化的 PCR 產物

3. 特殊設備

熒光計、金屬箔紙、微量離心管

4. 其他

PicoGreen dsDNA Quantitation 試劑盒 (MolecularProbes，P-7589)

二、方法

1.準備標準濃度的 DNA。將 lul 標準的λ-DNA（100ug/ml) 稀釋到 49ulTE 中，使準濃度的 DNA 的最終濃度為 2ng/ul；另取 3 個管，分別加入 60ng、20ng 、2ngDNA, 用TE 補至 50ul; 再準備一個空白對照，只加 50ulTE。

2.準備樣品：通常 0.5ul 或更少的 PCR 純化產物是足夠的，用 TE 補至 50ul。

3.將 PicoGreen 試劑用 TE1:200 稀釋，然后用鋁箔紙包裹以避光，每一個 DNA 樣和空白對照中加入 50ul 稀釋的 PicoGreen, 混合均勻，黑暗條件下放置 5 min。

4.用熒光計讀取空白對照，并用最高濃度的標準 DNA 校準，再測定其他標準樣品，檢測校準的線性，然后測量樣品。

方法 B: 比較溴化物染色法

如果沒有熒光計，可以采用瓊脂糖凝肢電泳估測 PCR 產物的濃度，通過溴化物染色后條帶的亮度與已知量的 DNA 進行比較，從而對 PCR 產物定量。高和低 DNA 量梯度標準（Invitrogen,10496016 和 10068013,respectively) 是較為有用的 DNA 量標準，其中所含的每一種 DNA 片段的物質的量相等，高分子量標準是 1~10kb，低分子量標準是 0.1~2.0kb。