由于各種PCR反應條件(如PCR擴增次數、溫度、Taq DNA聚合酶的濃度、引物、氯化鎂以及模板DNA)變異極大,應根據具體情況,對各種PCR反應條件進行相應調整。
按以下次序,將各成分加入0.2 ml滅菌擴增管中:
成分 體積 終濃度
10 × PCR緩沖液 5 μl 1 ×
10 mM dNTP溶液(pH 8.0) 1 μl 每種0.2 mM
10 μM 上游引物 2.5 μl 0.5 μM
10 μM 下游引物 2.5 μl 0.5 μM
5單位/μl 耐熱DNA聚合酶 0.5 μl 2.5單位
DNA模板 1-10 μl 1 pg-1μg
消毒的蒸餾水 至50 μl
1.對于多管反應可配制混合液于一管中,然后分裝至各管,以減少試劑損失和各管分別加樣的不準確性。
2.將小管中的混合物混勻,并加入50 μl礦物油或硅化油覆蓋小管中的混合物。
3.蓋緊小管,短暫離心,以使PCR混合物沉于管底。
4.小管在溫度循環器(PCR儀)中94oC溫育3分鐘,以使模板DNA完全變性。
5. 按以下方法進行25-35個循環的PCR擴增:
變性 94oC 30秒
退火 55oC 30秒
延伸 72oC 1分鐘/1 kb
6.72oC溫育PCR樣本10分鐘,可于4oC維持。樣本可貯存于-20oC直至使用。
7.采用瓊脂糖凝膠電泳分析PCR反應產物,溴化乙錠染色顯影DNA,用合適分子量標準的DNA作參照。