PCR技術的發展（下）

接著上期，我們繼續回到故事里面。

關于Mullis發現PCR的過程，比較公認的版本是，有一天他駕車開過蜿蜒山路的時候，開始琢磨他的檢測單堿基突變的方法。這一次他想到的點子是，既然結合一條引物是可行的，為什么不試試看同時結合兩條引物呢。于是Mullis開始在腦海里模擬這個實驗：設計兩條引物，分別結合在DNA的正義鏈和反義鏈上，且這兩條引物的3’端均位于待測堿基的上游1個堿基的位置。這樣，當進行Oligomer Restriction檢驗的時候，兩條鏈上都會延伸結合上相應的ddNTP。只需要在原先設計引物的時候將兩個引物的長度設計得不一樣，得到的兩個產物就能夠在DNA膠上被區分開來。這樣，一次檢測就能同時得到兩個結果，這兩個結果可以互為對照組，如果兩條鏈的結果得到的堿基可以互相配對成功，那么證明實驗體系沒有問題，結果可信；反之，如果兩條鏈結果不一致，那么很有可能是實驗過程中出現了問題。

Mullis開始模擬實驗：如果混入了dNTP，那么聚合酶在延伸DNA鏈時則會有時用dNTP有時用ddNTP，使得ddNTP結合的位置就變得不確定，通過他的對照組的設計就能夠檢測出來，該組實驗結果不能采信。很好，對照組的效果不錯。那么，有沒有什么辦法可以避免dNTP的混入呢？比如用堿性磷酸酶（BAP,Bacteria Alkaline Phosphate）呢？用BAP除去原有混合物里面的磷酸基團，隨后再加入ddNTP開始反應，這樣應該不錯。不過得想個辦法在加入ddNTP之前除去BAP的活性。

由于一時想不到好的解決辦法，于是Mullis便開始想，那么就先這樣吧，讓那些混入的dNTP先留 在反應體系里面，看看會發生什么事。于是，在那條漫長的公路上，他又開始繼續他的思維模擬實驗。這一次，他碰到了真理——PCR。當Mullis繼續想著他的模擬實驗的時候，他距離真理已經越來越近了。如果原先的反應體系里面混有dNTP，那么不妨先加入DNA聚合酶讓反應發生，這時dNTP就會被作為原料完成DNA復制的反應；而此時只需要加熱使DNA雙鏈變性，再冷卻復性時由于引物的量很多，因此原來的DNA鏈與引物結合的可能性最大，這樣就達到了去除dNTP的目的。但是，如果dNTP的量比較多，延伸得比較長，使得變性復性之后，新合成的鏈與下游的反向引物結合了呢？  

EUREKA（找到了）！這樣也沒有關系，不就是模板鏈加倍了嗎！單堿基突變檢測照常進行！那么我可以有意多加引物保證模板鏈復制以提高效率！如果像這樣一遍一遍重復，那么模板DNA就可以不斷復制擴增了！單堿基檢測的效率就大大提高了！

于是Mullis開始給Cetus其他的科學家們講他的想法，但是除了他的女友Jennifer以及為數不多的幾個技術員之外，其余的人都對他的想法并不感興趣。不過同時，他的同事們也并不能從他的設計里面挑出任何漏洞。也就意味著，很有可能方案可行。

接下來就是實驗驗證了，在實驗中他也經歷了一些挫折。終于在1984年Mullis和Cetus公司對于PCR技術申請了技術ZL，并且撰寫了文章發表。由公司撰寫的關于PCR技術應用的文章很快在Science上刊發，但是由于種種原因，Mullis撰寫的PCR原理的文章先后被nature和Science拒絕，最后只能發表在不知名的Methods of Enzymology （《酶學方法》）雜志上（真是天大的遺憾啊，估計此時nature和Science腸子都悔青了！）。

寫到最后，回顧PCR發明的科學歷程，還是非常有趣的。通常我們研究一個科學問題的思路，是提出一個重大的科學問題（Question），找到一個適合的研究體系（System），并借助于相關的技術（Technique）進行實驗探索與猜想驗證。如果不是這個思維極度發散，同時又善于抓住重要問題的“科學怪才”，即便是好點子送上們來也只怕會擦肩而過了。