PCR擴增產物的克隆

平頭連接是將制備好的平頭載體和補平或削平的PCR產物直接進行連接。載體可用EcoR V或Sma I切成平頭；PCR產物純化后，可以在22℃用DNA聚合酶I作用30min（利用該酶所具有的3'→5'外切酶活性和5'→3'的聚合酶活性）。

如果要求不高，PCR產物也可不加處理。如果使用Stratagene公司的pfu DNA聚合酶或New England Biolabs公司的Vent DNA聚合酶，這兩種酶有5'→3'校對能力，擴增出來的PCR產物已經是平頭，可以不作平端處理。平端連接的一個顯而易見的缺陷是連接效率低下，即使使用很高單位的連接酶，或在反應體系中加入PEG 8000，也只能很有限地提高效率。

通常情況下，PCR產物可直接與平端載體DNA進行連接，但其連接效率效低。因為Taq DNA聚合酶具有非模板依賴性末端轉移酶活性，能在兩6條 DNA鏈的3'末端加上一個多余的堿基，使合成的PCR產物成為3'突出一個堿基的DNA分子。

這種DNA分子的連接效率很低。由于PCR產物的效率通過較高，在采用大量T4 DNA連接酶并配以5-10u T4 RNA連接酶時，可顯著提高其連接效率。

對于較短PCR產物，用PUS19的HincⅡ位點進行克隆，以X-gal和IPTG篩選，常可得到足量重組子。另一種提高克隆效率的途徑是先用Klenow大片段或T4DNA聚合酶消去3'末端突出堿基將PCR產物變成平端DNA，然后再用平端連接法克隆PCR產物。

模板DNA

SauI Klenow片段 T4連接酶

移液器 移液器吸頭 PCR小管 DNA擴增儀 電泳槽 電泳儀 臺式高速離心機

一、PCR反應

1.  依次混勻下列試劑

（1）H₂O：35 ul

（2）10×PCR反應緩沖液：5 ul

（3）25 mmol/L MgCl₂：4 ul

（4） 4種dNTP：4 ul

（5）上游引物（引物1）：0.5 ul
 

（6）下游引物（引物2）：0.5ul

（7）模板DNA（約1 ng）：0.5 ul

（8）混勻后離心5秒。

2.  將混合物在94℃下加熱5分鐘后冰冷，迅速離心數秒， 使管壁上液滴沉至管底，加入Taq DNA聚合酶（0.5  ul 約2.5 U），混勻后稍離心，加入一滴礦物油覆蓋于反應混合物上。

3.  用94℃變性1分鐘，45℃退火1分鐘， 72℃延伸2分鐘， 循環35輪，進行PCR。最后一輪循環結束后， 于72℃下保溫10分鐘，使反應產物擴增充分。

二、電泳

取10  ul 擴增產物用1％瓊脂糖凝膠進行電泳分析，檢查反應產物及長度。

三、PCR產物的純化

擴增的PCR產物如利用T-Vector進行克隆，可直接使用，如用平未端或粘性未端連接，往往需要將產物純化。

1.  酚/氯仿法

（1）取反應產物加100  ul TE。

（2）加等體積氯仿混勻后用微型離心機10000 rpm離心15秒，用移液器將上層水相吸至新的小管中。這樣抽提一次， 可除去覆蓋在表面的礦物油。

（3）再用酚:氯仿:異戊醇抽提二次，每次回收上層水相。

（4）在水相中加300  ul 95％乙醇，置-20℃下30 min沉淀。

（5）在小離心機上10000 rpm離心10 min，吸凈上清液。加入1 ml 70％乙醇，稍離后，吸凈上清液.重復洗滌沉淀2次。將沉淀溶于7 ml ddH₂O 中，待用。

2.  Wizard PCR DNA純化系統

Wizard PCR DNA純化系統可以快速、有效、可靠地提取PCR擴增液中的DNA，提純后的DNA可用于測序、標記、克隆等。 該系統中含有的試劑和柱子可供50次PCR產物的純化，試劑包括：50 ml Wizard PCR DNA純化樹脂、5 ml 直接提取緩沖液、50支 Wizard微型柱。

（1）吸取PCR反應液水相放于1.5 ml eppendorf管中。

（2）加100 ml直接提取緩沖液，渦旋混勻。

（3）加1 ml PCR DNA純化樹脂，1分鐘內渦旋混合3次。

（4）取一次性注射器， 取出注塞，并使注射筒與Wizard微型柱連接，用移液槍將上述混合液加入注射筒中，并用注塞輕推，使混合物進入微型柱。

（5）將注射器與微型柱分開，取出注塞， 再將注射筒與微型柱相連，加入2 ml 80%異丙醇，對微型柱進行清洗。

（6）取出微型柱置于eppendorf管中，12 000 g離心20秒，以除去微型柱中的洗液。

（7）將微型柱放在一個新eppendorf管中，加50  ul TE或水，靜止1分鐘后，12 000 g離心20秒。

（8）丟棄微型柱，eppendorf管中的溶液即為純化DNA，存放于4℃或-20℃。

四、載體加dT尾

1.  將1 ug pUC19用SmaⅠ全酶切。

2.  在小管中按上述PCR反應，加入各種混合物，除將4 ul 4種dNTP改為4 ul 25 mM dTTP。

3.  加入1 ul(5U)的Taq DNA聚合酶在72℃下加熱2 h。

4.  按前面三中所述，用酚:氯仿:異戊醇抽提二次。

5.  加入2倍體積 95％乙醇，在-20℃下沉淀1 h。

6、離心，用70%乙醇漂洗后，真空抽干，溶于10ml ddH2O中。

五、PCR產物與載體粘末端連接

1.  在7 ml PCR產物中加1 ml帶dT尾的pUC質粒。

2.  加1 ml T4DNA連接酶，1 ml 10×連接緩中液，混勻，16℃連接過夜。

3.  取5 ml連接產物轉化感受態細胞并篩選重組子。

六、PCR產物3'突出端切平及平末端連接

1.  在50 ml的PCR產物中，直接加0.5 ml T4 DNA聚合酶混勻。

2.  37℃反應10分鐘后，70℃滅活10分鐘。

3.  用酚:氯仿抽提2次。

4.  乙醇沉淀。沉淀用70%乙醇漂洗后，真空抽干，溶于7 ml ddH₂O中。

5.  質粒用Smal 切開后，70℃ 15分鐘滅活酶，取1 ml （約0.1 mg）加入上述PCR產物中。加T4 DNA連接酶1 ml ，連接緩沖液1 ml 。

6.  取5 ml 連接產物轉化感受態細胞并篩選重組子。

1.  PCR反應液可直接用于連接，但最好對PCR產物純化后進行連接，既能去掉dNTP與ATP競爭連接酶又能濃縮PCR產物。

2.  PCR非常靈敏， 操作應盡可能在無菌操作臺中進行。

3.  吸頭、離心管應高壓滅菌， 每次吸頭用畢應更換， 不要互相污染試劑。

4.  加試劑前， 應短促離心10秒鐘， 然后再打開管蓋， 以防手套污染試劑及管壁上的試劑污染吸頭側面。

5.  應設含除模板DNA所有其它成分的負對照。

6.  純化樹脂在使用前必須充分混勻。

7.  PCR產物中礦物油應盡量吸去，否則會影響提取DNA的 產量。

一、 PCR反應中的主要成份

1.  引物
 

PCR反應產物的特異性由一對上下游引物所決定。引物的好壞往往是PCR成敗的關鍵。引物設計和選擇目的DNA序列區域時可遵循下列原則：

（1） 引物長度約為16-30 bp， 太短會降低退火溫度影響引物與模板配對，從而使非特異性增高。太長則比較浪費，且難以合成。