PCR引物設計原則

　PCR引物設計的目的是為了找到一對合適的核苷酸片段，使其能有效地擴增模板DNA序列。因此，引物的優劣直接關系到PCR的特異性與成功與否。 
　　要設計引物首先要找到DNA序列的保守區。同時應預測將要擴增的片段單鏈是否形成二級結構。如這個區域單鏈能形成二級結構，就要避開它。如這一段不能形成二級結構，那就可以在這一區域設計引物。
　　現在可以在這一保守區域里設計一對引物。一般引物長度為15~30堿基，擴增片段長度為100~600堿基對。
　　讓我們先看看P1引物。一般引物序列中G+C含量一般為40%~60%。而且四種堿基的分布最好隨機。不要有聚嘌呤或聚嘧啶存在。否則P1引物設計的就不合理。應重新尋找區域設計引物。
　　同時引物之間也不能有互補性，一般一對引物間不應多于4個連續堿基的互補。
　　引物確定以后，可以對引物進行必要的修飾，例如可以在引物的5′端加酶切位點序列；標記生物素、熒光素、地高辛等，這對擴增的特異性影響不大。但3′端絕對不能進行任何修飾，因為引物的延伸是從3′端開始的。這里還需提醒的是3′端不要終止于密碼子的第3位，因為密碼子第3位易發生簡并，會影響擴增的特異性與效率。
　　 綜上所述我們可以歸納十條PCR引物的設計原則：
　　① 引物應用核酸系列保守區內設計并具有特異性。
　　② 產物不能形成二級結構。
　　③ 引物長度一般在15~30堿基之間。
　　④ G+C含量在40%~60%之間。
　　⑤ 堿基要隨機分布。
　　⑥ 引物自身不能有連續4個堿基的互補。
　　⑦ 引物之間不能有連續4個堿基的互補。
　　⑧ 引物5′端可以修飾。
　　⑨ 引物3′端不可修飾。
　　⑩ 引物3′端要避開密碼子的第3位。
　　 PCR引物設計的目的是找到一對合適的核苷酸片段，使其能有效地擴增模板DNA序列。如前述，引物的優劣直接關系到PCR的特異性與成功與否。對引物的設計不可能有一種包羅萬象的規則確保PCR的成功，但遵循某些原則，則有助于引物的設計。
　　 1.引物的特異性
　　引物與非特異擴增序列的同源性不要超過70%或有連續8個互補堿基同源。
　　 2.避開產物的二級結構區
　　 某些引物無效的主要原因是引物重復區DNA二級結構的影響，選擇擴增片段時最好避開二級結構區域。用有關計算機軟件可以預測估計mRNA的穩定二級結構，有助于選擇模板。實驗表明，待擴區域自由能（△G°）小于58.6lkJ/mol時，擴增往往不能成功。若不能避開這一區域時，用7-deaza-2′-脫氧GTP取代dGTP對擴增的成功是有幫助的。
　　 3.長度
　　 寡核苷酸引物長度為15~30bp，一般為20~27mer。引物的有效長度：Ln=2（G+C）+（A+T+，Ln值不能大于38，因為>38時，最適延伸溫度會超過Taq DNA聚合酶的最適溫度（74℃),不能保證產物的特異性。
　　4.G+C含量
　　G+C含量一般為40%~60%。其Tm值是寡核苷酸的解鏈溫度，即在一定鹽濃度條件下，50%寡核苷酸雙鏈解鏈的溫度，有效啟動溫度，一般高于Tm值5~10℃。若按公式Tm=4（G+C）+2（A+T）估計引物的Tm值，則有效引物的Tm為55~80℃，其Tm值最好接近72℃以使復性條件最佳。
　　 5.堿基礎隨機分布
　　引物中四種堿基的分布最好是隨機的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3′端不應超過3個連續的G或C，因這樣會使引物在G+C富集序列區錯誤引發。
　　 6.引物自身　　 
　　引物自身不應存在互補序列，否則引物自身會折疊成發夾狀結構牙引物本身復性。這種二級結構會因空間位阻而影響引物與模板的復性結合。若用人工判斷，引物自身連續互補堿基不能大于3bp。
　　 7.引物之間
　　 兩引物之間不應不互補性，尤應避免3′端的互補重疊以防引物二聚體的形成。一對引物間不應多于4個連續堿基的同源性或互補性。
　　 8.引物的3′端
　　引物的延伸是從3′端開始的，不能進行任何修飾。3′端也不能有形成任何二級結構可能，除在特殊的PCR（AS-PCR）反應中，引物3′端不能發生錯配。
　　在標準PCR反應體系中，用2U Taq DNA聚合酶和800μmol/L dNTP（四種dNTP各200μmol/L）以質粒（103拷貝）為模板，按95℃，25s；55℃，25s；72℃，1min的循環參數擴增HIV-1 gag基因區的條件下，引物3′端錯配對擴增產物的影響是有一定規律的。A∶A錯配使產量下降至1/20，A∶G和C∶C錯七下降至1/100。引物A：模板G與引物G：模板A錯配對PCR影響是等同的。
　　 9.引物的5′端
　　引物的5′端限定著PCR產物的長度，它對擴增特異性影響不大。因此，可以被修飾而不影響擴增的特異性。引物5′端修飾包括：加酶切位點；標記生物素、熒光、地高辛、Eu3+等；引入蛋白質結合DNA序列；引入突變位點、插入與缺失突變序列和引入一啟動子序列等。
　　 10.密碼子的簡并
　　 如擴增編碼區域，引物3′端不要終止于密碼子的第3位，因密碼子的第3位易發生簡并，會影響擴增特異性與效率。