PCR基因擴增儀的原理和程序

  PCR技術即基因擴增技術。

    PCR基因擴增儀擴增DNA的原理是：先將含有所需擴增分析序列的靶DNA雙鏈經熱變性處理解開為兩個寡聚核苷酸單鏈，然后加入一對根據已知DNA序列由人工合成的與所擴增的DNA兩端鄰近序列互補的寡聚核苷酸片段作為引物，即左右引物。此引物范圍就在包括所欲擴增的DNA片段，一般需20-30個堿基對，過少則難保持與DNA單鏈的結合。引物與互補DNA結合后，以靶DNA單鏈為模板，經反鏈雜交復性（退火），在Taq DNA聚合酶的作用下以4種三磷酸脫氧核苷（dNTP）為原料按5'到3'方向將引物延伸、自動合成新的DNA鏈、使DNA重新復制成雙鏈。然后又開始第二次循環擴增。引物在反應中不僅起引導作用，而且起著特異性的限制擴增DNA片段范圍大小的作用。新合成的DNA鏈含有引物的互補序列，并又可作為下一輪聚合反應的模板。如此重復上述DNA模板加熱變性雙鏈解開—引物退火復性—在DNA聚合酶作用下的引物延伸的循環過程，使每次循環延伸的模板又增加1倍，亦即擴增DNA產物增加1倍，經反復循環，使靶DNA片段指數性擴增。

    PCR的擴增倍數Y=（1+E）n,這里Y是擴增量，n為PCR的循環次數。E為PCR循環擴增效率。設PCR擴增效率E為100%、循環次數n=25次，靶DNA將擴增到33554432個拷貝，即擴增3355萬倍：若E為80%、n=20、則擴增數量將下降到1408865拷貝，即擴增產物約丟失93%，若E=100%，n=20，則擴增數量減少1048576個拷貝，擴增產物約減少97%。可見PCR循環擴增效率及循環次數都對擴增數量有很大影響。PCR擴增屬于酶促反應，所以，DNA擴增過程遵循酶促動力學原理。靶DNA片段的擴增zui初表現為直線上升，隨著靶DNA片段的逐漸積累，當引物—模板/DNA/聚合酶達到一定比值時，酶的促化反應趨于飽和，此時靶DNA產物的濃度不再增加，即出現所謂平臺效應。PCR反應達到平臺期的時間主要取決于反應開始時樣品中的靶DNA的含量和擴增效率，起始模板量越多到達平臺期的時間就越短、擴增效率越高到達平臺期的時間也越短。另外酶的含量，dNTp 濃度，非特異性產物的擴增都對到達平臺期時間有影響。