Northwestern 篩選蛋白表達文庫的方法是通過構建 IPTG 可誘導的融合蛋白表達文庫（融合蛋白的 N 端由載體序列編碼，C 端由克隆到載體的 cDNA 文庫編碼），進而誘導融合蛋白表達，并將蛋白質固定于硝酸纖維素濾膜上，以標記的 RNA 探針進行篩選，最終獲取能與靶 RNA 分子特異性結合蛋白質的 cDNA。本實驗來源「RNA 實驗指導手冊」主編：鄭曉飛
| 實驗方法原理 | Northwestern 篩選蛋白表達文庫的方法是通過構建 IPTG 可誘導的融合蛋白表達文庫（融合蛋白的 N 端由載體序列編碼，C 端由克隆到載體的 cDNA 文庫編碼），進而誘導融合蛋白表達，并將蛋白質固定于硝酸纖維素濾膜上，以標記的 RNA 探針進行篩選，最終獲取能與靶 RNA 分子特異性結合蛋白質的 cDNA。 |
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| 實驗材料 | 表達庫宿主菌抗生素 |
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| 試劑、試劑盒 | SM 緩沖液IPTG封閉緩沖液漂洗緩沖液結合緩沖液洗脫緩沖液FicollPVPBSATorula yeast core RNA |
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| 儀器、耗材 | NZY 培養基LB 培養基NZY 頂層瓊脂NZY 平板硝酸纖維素膜RNA 探針 |
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| 實驗步驟 | ―、材料與設備
1. 表達庫：多采用 λ 噬菌體載體構建表達庫，可根據需要選取載體。可購買預先制備好的表達庫（Stratagenc 公司，Clontech 公司等均有售），也可以自己制備載體庫。如 λgt11、λZAP 或 λORF8 等載體的多克隆位點前有 lacZ 基因，使融合蛋白能被 TPTG 誘導表達。改進型載體如 λTriplEx 可以使三個讀碼框都得到翻譯，保證了蛋白質的表達。此外，還可以將組蛋白與 β-半乳糖苷酶融合，以便釆用藍-白斑篩選重組體；在 λTriplEx 載體中加入 E.coli ompA 基因的 5'-UTR 可以提高重組體的穩定性。
2. 宿主菌：宿主菌一定要與庫載體相對應。如 E.coli XL I-blue 可用作 λTriplEx 載體和 λZAP 載體的宿主菌。XL I-blue 菌的附加體 F' 中含有 △M15 lacZ 和 lac Iq 基因：△M15 lacZ 基因的表達可以通過 α 互補對重組克隆進行藍-白斑篩選；lacIq 基因編碼 lac 抑制子，在誘導劑 TPTG 不存在時抑制 lacZ 啟動子的轉錄。
3. NZY 培養基：5 g NaCl，2 g MgSO4·7H2O，5 g 酵母提取物，10 g NZ胺（酪蛋白的酶促水解產物），定容至 1 L，高壓滅菌后保存。
4. LB 培養基：10 g 蛋白胨，5 g 酵母提取物，10 g NaCl，定容至 1 L，調 pH 7.4，高壓滅菌后保存。
5. NZY 頂層瓊脂：NZY 培養基中加 0.7% 瓊脂糖，高壓滅菌。
6. NZY 平板：在 1 L NZY 培養基中加 15 g 瓊脂粉，高壓滅菌后鋪板（約 70 ml/150 mm 培養皿，約 30 ml/100 mm 培養皿）。
7. 抗生素：氨芐青霉素：50 μg/ml；四環素：12.5 μg/ml。
8. SM 緩沖液：5.8 g NaCl，2 g MgSO4·7H2O，50 ml 1 mol/L Tris-HCl（pH 7.5），5 ml 2% 明膠，定容于 1 L，高壓滅菌。
9. 0.5 mol/L IPTG，X-Gal（2.5 g X-Gal 溶解于 10 ml 二甲基甲酰胺中），20% 麥芽糖，均過濾除菌。
10. 硝酸纖維素膜（建議使用 supported nitnKdliilose，BA-S85，Schleicher&-Schuell 公司）。
11. 32P 標記的 RNA 探針：常規制備，以含 7 mol/L 尿素的丙烯酰胺膠垂直電泳對探針進行純化，用 HSCB 緩沖液 [ 25 mmol/L Tris-HCl（pH 7.5 )，400 mmol/L NaCl，0.1% SDS ] 洗脫過夜。
12. 封閉緩沖液：5 mg/ml Torula yeast core RNA（Sigma 公司），10 mmol/L Tris- HCl（pH 7.8），150 mmol/L NaCl。
13. 漂洗緩沖液：10 mmol/L Tris-HCl（pH 7.8 )。
14. 結合緩沖液：10 mmol/L Tris-HCl（pH 7.8），1 mmol/L EDTA，0.02% Ficoll，0.02% 聚乙稀吡咯烷酮（polyvinylpyrrolidone，PVP），0.02% 牛血清白蛋白及預試驗確定濃度的 NaCl（通常為 50 mmol/L 左右）。
15. 洗脫緩沖液：10 mmol/L Tris-HCl（pH 7.8），1 mmol/L EDTA，0.02% Ficoll，0.02% PVP，0.02% 牛血清白蛋白及預試驗確定濃度的 NaCl（通常為 100 mmol/L 左右）。
16. 2% Ficoll（10X 儲存液）：2 g Ficoll ( type 400 ) 溶解于 100 ml 蒸餾水中，110℃ 滅菌 15 min，4℃ 可保存 1 個月。
17. 2% PVP（10X 儲存液）：2 g PVP（分子質量為 40000 Da）溶解于 100 ml 蒸餾水中，110°C 滅菌 15 min，4°C 可保存 1 個月。
18. 2% BSA（10X 儲存液）：2 g 高純度的牛血清白蛋白溶解于 100 ml 蒸餾水中，過濾除菌，-20℃ 保存。
19. 50 mg/ml Torula yeast core RNA（10X 儲存液）：5 g Torula yeast core RNA 溶解于 100 ml 蒸餾水中，蛋白酶 K（0.25 mg/ml）37℃ 處理 1 h，酚：氯仿抽提，乙醇沉淀以去除污染的核酸酶。
二、操作方法
1. λ 噬菌體庫的保存與操作
購買獲得的 λ 噬菌體文庫大多保存在 7% DMSO 中，DMSO 對噬菌體的活性沒有影響，因此不必去除即可直接進行操作。若要長期儲存，應將其分裝成 50 μl 小份，于 -80℃ 保存，避免反復凍融，若要對文庫進行稀釋，則需采用 SM 緩沖液；工作樣品可以在 4℃ 保存 2 個月。
在進行實驗前，最好對購買的文庫進行滴度檢測，好的 cDNA 文庫應 ≥108pfu/ml，并且應含有 ≥104 的不同克隆，以保證所表達蛋白質的多樣性。此外，還要求至少含有 75% 的重組克隆。
2. 宿主菌制備
接種單克隆宿主菌至 50 ml 含有 10 mmol/L MgSO4、0.2% 麥芽糖（MgSO4 和麥芽糖可以幫助噬菌體進入宿主菌）的 LB 培養液中，30℃ 120 r/min 振搖培養過夜，至 OD600 達 2.0。較低的溫度和通氣量可以保證過夜培養不會生長過度。
2000 r/min 離心 5 min 收集菌體，去除上清，用 10 mmol/L MgSO4 溶液重懸，使 OD600 介于 0.5 至 1.0 之間。一定要避免使用渦旋振蕩器，但又要保證細胞完全重懸。重懸的細菌可在 4℃ 保存 1 個星期，而不出現明顯的活性降低。
3. 噬菌體表達庫涂板
(1) 在 20 個反應管中分別加入 1 ml MgSO4 重懸的細菌懸液和適量的噬菌體文庫（約 5X104 pfu），37℃ 孵育 15~20 min，使噬菌體進入宿主菌。
(2) 在每個反應管中逐次加入 9 ml 融化的 NZY 頂層瓊脂，并立即涂布 150 mm NZY 平板（融化的 NZY 頂層瓊脂應冷卻至 45℃ 再使用；每個反應管需在加入 NZY 頂層瓊脂后立即涂板；NZY 平板需在 37℃ 預熱，加入 NZY 頂層瓊脂后盡快轉動平板以使細菌層 分布均勻；20 個反應管的篩選總數為約 106 噬菌斑）。室溫放置 10 min 使頂層瓊脂凝固，倒置平板于 37℃ 孵育 3~5 h 至微小的噬菌斑出現。在孵育過程中注意不要將平板疊放以保證每塊板溫度一致，使噬菌斑同時出現。
4. IPTG 誘導蛋白表達及蛋白的轉膜
(1) 用圓珠筆在硝酸纖維素濾膜上不與平板接觸面進行標號。在孵育平板的過程中，將膜浸入 10 mmol/L IPTG 中 30 min，再放在 3 MM 濾紙上吸干 5 min，確保膜在鋪到平板上時處于微濕狀態。在操作中需戴手套，并使用滅菌的鑷子。
(2) 將用 IPTG 預處理過的膜鋪在長出噬菌斑的平板上，37°C 孵育 4 h 誘導重組蛋白的表達。
(3) 對膜和平板做好標記后（可以用大頭針在不同的位置進行標記）小心取下膜，注意不要帶下頂層瓊脂，可以在取膜前先將平板和膜在冰箱內放置 15 min 后再取膜。將取下的膜放在 3 MM 濾紙上吸干 5 min 后浸入封閉緩沖液，平板保存于 4℃ 備用。
5. RNA 探針制備
(1) 用 T7/T3/SP6 RNA 聚合酶體外轉錄制備探針。通常使用 [ α-32P ] UTP 進行標記，合成的 RNA 中近 1/10 的尿嘧啶核苷酸標記了同位素。
(2) 轉錄后，用酚對 RNA 進行抽提，再用 50% 的含 7 mol/L 尿素的丙烯酰胺凝膠垂直電泳對探針進行純化。放射自顯影確定探針位置，切膠回收，用 HSCB 緩沖液過夜洗脫得到 RNA 探針，用酚：氯仿進行抽提并進行定量。
6. 探針與膜的共孵育
(1) 結合有噬菌體蛋白的硝酸纖維膜在封閉緩沖液中進行預雜交，37℃ 搖床孵育 1 h ( 40~50 r/min ) 封閉非特異結合位點。封閉緩沖液和雜交緩沖液均十分黏稠，操作中不僅要避免起泡，還要盡量保證與膜作用的均一。操作中所用的容器和器具都應預先處理， 避免核酸酶污染。
(2) 用 500 ml 漂洗緩沖液洗膜兩次，立即轉入 100 ml 加有探針 RNA 的結合緩沖液中。于室溫在搖床 ( 40~50 r/min ) 上孵育 1 h。
7. 洗膜
用 250 ml 洗脫緩沖液洗膜，重復數次直至放射性本底水平降至最低。可用對應于未經噬菌體轉染的細菌板的蛋白交聯膜作為陰性對照。
8. 放射自顯影挑取陽性克隆
將膜放在 3 MM 濾紙吸干，用保鮮膜包裹，-70℃ 放射自顯影。曝光時間取決于探針的濃度和信號的強度（對于 107 cpm/ml 的探針，曝光 8~16 h 就可以觀察到陽性結果）。此外，可以在蛋白轉膜過程中重復一次轉膜操作，得到兩張對應同一塊培養板的膜， 進行雜交反應。
將定影后的 X 射線片與膜、培養板進行對照，找出陽性點對應在平板上的噬菌斑的位置。從板上挑取陽性噬菌斑，分別加入 1 ml SM 緩沖液和 2 滴氯仿洗脫獲取噬菌體。
9. 陽性克隆的確證
為證實所獲陽性克隆的可靠性，需要進行二次篩選。從平板上過夜洗脫得到的噬菌體顆粒重新鋪板，密度約為 100 mm NZY 瓊脂平板有 200 個克隆，操作同前。第二次篩選的硝酸纖維素膜上的陽性克隆數應該增多，挑取單個的陽性克隆。如果需要，還可以進行第三輪篩選，這次每塊平板約鋪 50 個克隆。 |
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