NAD 激酶（NAD kinase, NADK）試劑盒說明書
分光光度法 50 管/24 樣 注 意：正式測定前務必取 2-3 個預期差異較大的樣本做預測定 測定意義： NADK（EC 2.7.1.23）廣泛存在于動物、植物、微生物和培養細胞中，是目前所發現的生物體內惟一能夠 催化 NAD+磷酸化生成 NADP+的酶，可催化 NAD(H)以 ATP 或無機多聚磷酸[poly(P)]作為磷酰基供體進行 磷酸化反應，生成 NADP(H)。因此，NAD 激酶在合成 NADP(H)以及調節 NAD(H)與 NADP(H)的平衡上具 有重要作用。 測定原理： NADK 催化 NAD+磷酸化，生成 NADP+；NADP+可被 6-磷酸葡萄糖脫氫酶還原為 NADPH；在 340 nm 下 測定 NADPH 增加速率。可反映出 NADK 活性的大小。 需自備的儀器和用品： 可見分光光度計、恒溫水浴鍋、臺式離心機、可調式移液器、1 mL 玻璃比色皿和蒸餾水。 試劑的組成和配制： 提取液：液體 50 mL×1 瓶，4℃保存； 試劑一：液體 25 mL×1 瓶，4℃保存； 試劑二：液體 50 mL×1 瓶，4℃保存； 試劑三：粉劑×1 瓶，-20 ℃保存； 試劑四：粉劑×1 瓶，-20℃保存； 樣本測定的準備： 1、細菌、細胞或組織樣品的制備： 細菌或培養細胞：先收集細菌或細胞到離心管內，離心后棄上清；按照細菌或細胞數量（104個）：提 取液體積（mL）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬細菌或細胞加入 1mL 提取液），超聲波破碎細菌或細 胞（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復 30 次）；8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上 待測。 組織：按照組織質量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入 1mL 提 取液），進行冰浴勻漿。8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。 2、血清（漿）樣品：直接檢測。 測定步驟： 1、分光光度計預熱 30min 以上，調節波長至 340nm，蒸餾水調零。 2、將試劑一和試劑二 37℃（哺乳動物）或 25℃（其它物種）水浴 15min 以上。 3、工作液Ⅰ的配制：在試劑三中加入 12mL 試劑一，充分混勻待用；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止 反復凍融； 工作液Ⅱ的配制：在試劑四中加入 45mL 試劑二，充分混勻待用；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止 反復凍融； 4、加樣表 試劑名稱(μL) 測定孔 對照管 QQ 1019057849 樣本 100 100 工作液Ⅰ 400 試劑一 400 充分混勻，37℃（哺乳動物）或 25℃（其它物種）水浴 15min，立即煮沸 2min（蓋緊，防止水分散失）冰浴冷卻，10000g，25℃離心 10min，取上清 上清液 200 200 工作液Ⅱ 800 800 加完試劑混勻，室溫靜置 15min，340nm 下測定吸光值，ΔA=A 測定-A 對照。 NADK 活性計算： 1、血清（漿）NADK 活力的計算: 單位的定義：每 mL 血清（漿）每分鐘生成 1 nmol 的 NADP 定義為一個酶活力單位。 NADK（nmol/min/mL）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109 ]÷V 樣÷T=53.59×ΔA 2、組織、細菌或細胞中 NADK 活力的計算: （1）按樣本蛋白濃度計算： 單位的定義：每 mg 組織蛋白每分鐘生成 1 nmol NADP 定義為一個酶活力單位。 NADK（nmol/min /mg prot）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109 ]÷(V 樣×Cpr) ÷T=53.59×ΔA÷Cpr （2）按樣本鮮重計算： 單位的定義：每 g 組織每分鐘生成 1 nmol NADP 定義為一個酶活力單位。 NADK（nmol/min /g 鮮重）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109 ]÷(W× V 樣÷V 樣總) ÷T=53.59×ΔA÷W （3）按細菌或細胞密度計算： 單位的定義：每 1 萬個細菌或細胞每分鐘生成 1 nmol NADP 定義為一個酶活力單位。 NADK（nmol/min /104 cell）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109 ]÷(500×V 樣÷V 樣總) ÷T=0.107×ΔA V 反總：反應體系總體積，5×10-4 L；ε：NADPH 摩爾消光系數，6.22×103 L / mol /cm；d：比色皿光徑， 25px；V 樣：加入樣本體積，0.1 mL；V 樣總：加入提取液體積，1 mL；T：反應時間，15 min；Cpr：樣本 蛋白質濃度，mg/mL；W：樣本質量，g；500：細菌或細胞總數，500 萬