LCMS／MS聯用技術的應用與發展

摘要：本文介紹了液相色譜-質譜，質譜聯用技術的新進展，綜述了近年來該技術的應用及其發展前景。

1前言

近年來，由于液相色譜-質譜，質譜(lc-ms／ms)聯用新技術的不斷出現，lc-ms／ms已成為現代分析手段中必不可少的組成部分。lc／ms的聯用始于70年代，90年代以來，由于大氣壓電離的成功應用以及質譜本身的發展，液相色譜與質譜的聯用，特別是與串聯質譜(ms/ms)的聯用得到了極大的重視和發展。lc-ms／ms聯用的優點非常顯著，因為氣相色譜只能分離易揮發且不分解的物質，而液相色譜則把分離范圍大大拓寬了，生物大分子也能分離，lc與高選擇性、高靈敏度的ms／ms結合，可對復雜樣品進行實時分析，即使在lc難分離的情況下，只要通過ms1及ms2對目標化合物進行中性碎片掃描，則可發現并突出混和物中的目標化合物，顯著提高信噪比。

液-質聯用是通過一個“接口”來實現的。在接口研制方面，前后發展了有20多種，其中主要有直接導入界面、傳送帶界面、滲透薄膜界面、熱噴霧界面和粒子束界面，但這些技術都有不同方面的限制和缺陷，直到大氣壓電離技術成熟后，液-質聯用才得以迅速發展，成為科研和日常分析的有力工具。

2接口基本原理

有關各種電離技術文獻已有評述，目前主要采用大氣壓電離(api)技術，api包括電噴霧電離(跚)和大氣壓化學電離(apci)。

2．1電噴霧電離(esi)

溶液中樣品流出毛細管噴口后，在霧化氣(n2)和強電場(3～6kv)作用下，溶液迅速霧化并產生高電荷液滴。隨著液滴的揮發，電場增強，離子向液滴表面移動并從表面揮發，產生單電荷或多電荷離子。通常小分子得[m+h]+或[m-h]-單電荷離子，生物大分子產生多電荷離子，由于質譜儀測量的是質，荷比(m/z)，可測定的生物大分子的質量數高達幾十萬。

esi是很軟的電離，可直接測定熱不穩定的極性化合物，多電荷形成可分析蛋白質和dna等生物大分子，調節離子源(源內id))電壓可以控制離子的斷裂，給出結構信息。

2．2大氣壓化學電離(apci)

溶液中樣品流出毛細管后仍由氮氣流霧化到加熱管中被揮發，在加熱管端的corona尖端放電電極(最初利用同位素ni的電子放射)使溶劑分子形成反應氣等離子體。樣品分子與等離子體通過氫質子交換被電離，形成[m+h]+或[m-h]-，并進入質譜儀。

apci也是很軟的電離，只產生單電荷峰，適合測定弱極性的小分子化合物。另外，它適應高流量的梯度洗脫，高低水溶液變換的流動相。通過調節離子源電壓，可以得到不同斷裂的質譜圖。

2．3接口形式

接口是液-質聯用的關鍵部分，在這里完成溶液的氣化和樣品分子的電離。由于大量生物樣品的背景基底非常復雜，即使經過分離，還會很“臟”。因此在接口設計時，既要考慮離子化的效率，亦要考慮接口的抗污染和耐用。圖給出了幾種不同的api“接口”形式，采用z字形通道離子束引進系統，避免了中性或非揮發性物質直接進入采樣孔，可有效地防止接口的玷污。

3應用

lc-ms／ms聯用是繼gc／ms聯用之后又一新興的分離檢測技術，近來發展極為迅速。它在生命科學、環境科學、法醫學、商檢等領域得到了廣泛應用。

3．1藥物及體內藥物分析

藥物的是用來預防、診斷及治療疾病的一類特殊物質，與人們的健康和生命安危有極其密切的關系，雜質檢查及其限度控制是保證藥品質量的一個重要方面。使用lc-ms／ms可以簡便地對藥物中雜質加以監控。nicolas對抗癌藥物dup941生產中有關雜質建立了lc-ms／ms指紋圖譜，不同生產的批次藥物與已建立的譜圖對照，從而達到質量控制目的。zhao鑒別和測定了氯沙坦片劑在儲存過程中產生的微量降解產物。rourick建立了鑒定藥品雜質及降解產物的lc-ms／ms方法，如頭孢羥氨芐通過酸堿或加熱處理使其降解，然后反相c18柱分離，利用ms／ms功能來鑒定雜質及降解產物的化學結構。

體內藥物分析是測定體液(主要是血漿、血清或全血)中藥物或其他代謝物濃度。由于血液樣品試樣提供量少，基質復雜，在此混合物中分析某種微量成分(通常為(g/ml或ng/ml水平)并加以鑒別，常常是對分析化學家的挑戰。

lc-ms雖然有足夠的靈敏度，但遇到lc難以分離的組分，其應用受到限制。使用lc-ms／ms可以克服背景干擾，通過ms／ms的選擇反應控制模式(srm)或多反應檢測模式(srm)，提高信噪比，因此對復雜樣品仍可達到很高的靈敏度。lc-ms／ms對生物樣品的提取、純化和濃縮等前處理過程沒有嚴格要求，一般采用液液萃取法(lle)或固相萃取法(spe)，但這兩種方法的缺點是比較費時。在線萃取技術在省時和省力方面顯出相當大的優越性。現有幾種在線萃取技術，如在線固相萃取、柱切換、涂層毛細管微萃取(ccme，有時又稱固相微萃取(spme)、多元lc系統等。在線萃取技術使得lc-ms／ms優點更加明顯，它可以實現微量、高通量樣品分析。

xia用兩根平行的樣品前處理柱oasis hlb(1×50mm，3μm)分別與一根分析柱相連接，利用柱切換技術在兩根平行的樣品處理柱之間交替進行凈化、富集。此方法的樣品量僅為10μl，凈化時間0.3min，整個樣品分析時間1.6min，而且方法精密度很好，日內、日間誤差6.6％。hempenius將96孔固相萃取裝置與lc-ms／ms相聯，血漿樣品直接注入孔內的spe柱中，凈化后的樣品再經lc分離，ms／ms采用選擇反應檢測模式(srm)，血漿樣品中的氟哌啶醇檢測限為0.1ng／ml，方法不準確度<10％，樣品分析時間約1.9min。takeshi對血液或尿液中11個添加的吩噻嗪類藥物進行了分析，采用spme法，樣品在毛細管內壁涂層中經過選擇性吸附與解吸，再經lc分離，ms或ms／ms檢測。wong開展了微透析-lc-ms／ms生物活體分析，方法是將微透析探針直接插入鼠的頸靜脈中，松果體素腹膜內注射后，透析液(連續15h，每隔0.5h)被自動注入到1.12-ms／ms儀中進行分析，實時了解松果體素在體內的生化過程及代謝情況。另外，wong采用相類似的方法，將微透析探針插入鼠腦紋狀體中，對神經遞質乙酰膽堿進行微小環境的活體分析。手性藥物在制藥行業中有著特殊意義，高通量手性液相串聯質譜可及時了解對映體在體內代謝過程，是手性藥物研究有力工具。lc-ms／ms可以鑒別分析體液中各種類型的藥物，文獻已報道有：羅丁諾森、茚地那韋、疊氮胸苷、齊多夫定、安替比林、奧美拉唑、恩丹西酮、孕三烯酮、右美沙芬、氟尼縮松、特樂福本、抗炎松、特比奈芬、新伐他丁、利多卡因、苯海拉明、雷帕霉素、利布樂定、福辛普利、普萘洛爾、普羅帕酮等。

天然產物(中藥材)成分復雜，對這些產物的分析，以及對其中活性成分鑒定確實困難。而lc-ms／ms可對天然產物進行成分鑒定和測定，如生曬參中人參皂甙、蒺藜中甾體皂甙、紫杉中紫杉醇、盾葉鬼臼根莖中木酚素和綠茶中兒茶素等。

3．2興奮劑，毒品檢測

1980年國際奧林匹克委員會把阿片、可卡因、麥角酰二乙胺(lsd)、苯丙胺、大麻、苯二氮卓和促蛋白合成類固醇列為禁用藥物，這些藥物在體內主要以代謝產物形式存在。例如，阿片類含有酚羥基或醇基等，很容易與人體內的葡糖醛酸結合；合成類固醇在體內以睪酮形式代謝。興奮劑，毒品檢測主要是根據尿液或血液中相當代謝產物的測定濃度，lc-ms／ms已被證明是一個有力工具。

cailleux采用液-液提取，細徑c18柱分離，esi源mrm檢測，分析了血液和尿液中阿片及其代謝產物(嗎啡、6-乙酰嗎啡、可待因和去甲可待因)，檢測低限10ng／all。salwson測定了血漿中嗎啡及其代兩個代謝產物嗎啡一3-葡糖苷酸(m3g)和嗎啡-6-葡糖苷酸(m6g)，對靜脈注射嗎啡(劑量0.14mg／kg)的吸毒者，在12小時內采的血樣分析得到：嗎啡，535pg／ml；m3g，17722pg／ml；m6g，3074pg／ml。singh將樣品通過加入乙晴沉降蛋白，上清液注入反相ymc base柱分離，apci源mrm檢測，測定了血漿中可卡因及其主要代謝物(苯甲酰愛康寧、愛康寧甲酯和去甲愛康寧)，線性范圍2～1000ng／ml，誤差<4.1％。soenoff建立了新生嬰兒血液(12μl)中苯甲酰愛康寧的確證方法，對可疑吸毒者出生的嬰兒進行鑒定。wang通過標準品和改變cld源，對可卡因及其15個重要代謝產物的裂解機理作了探討。clauwaen測定了頭發中可卡因及其代謝物苯甲酰愛康寧與可卡乙堿，結果與lc/熒光檢測的結果一致。clauwaen用lc-q-tof ms測定了血液中苯丙胺和相關化合物，結果與lc/熒光檢測法相一致，但線性動態范圍要高出2個數量級，在極低濃度時仍可進行ms／ms全掃描，對目標化合物進行絕對鑒定。gergov建立了尿液樣品中16個β-興奮劑篩選及確證的方法，采用ms1的sin模式篩選，呈陽性結果再經ms／ms產物離子掃描，通過譜庫檢索，得到準確的鑒定。cai用免疫親合柱提取尿液樣品中的lsd，微徑c18柱分離，esi源mrm檢測，檢出低限2.5pg/ml。另外，文獻還報道了體液中苯二氮卓、合成opioids、促蛋白合廊類固醇，以及天然生物堿如天仙子胺、利血平等lc-ms／ms測定方法。

3．3農藥，獸藥殘留量分析

食品中的農藥殘留量及其他有害成分的含量甚微，往往需要進行痕量分析，對分析方法的靈敏度要求較高。而lc-ms／ms具有極高的靈敏度，特別適合進行痕量分析，可以鑒別和測定各種類型的農藥、獸藥以及生物毒素等殘留物。如：蔬菜中殺蟲劑；谷物中矮壯素、瓜萎鐮菌醇；動物組織(肌肉、脂肪、肝、和腎)中慶大霉素、磺胺二甲嘧啶和甲氨芐氨嘧啶；肉制品中聚醚離子載體類獸藥(拉沙里菌素、莫能菌素、奈良菌素和鹽霉素)、雜環芳胺；雞蛋中硝基咪唑類；牛奶中慶大霉素和新霉素；啤酒中玉米赤霉烯酮；甲殼類水生物中yessotoxin毒素、azaspiracid毒素；土壤中咪唑啉酮；水樣(廢水、河水、地下水和飲用水)中苯磺酸根、除草劑、殺蟲劑等殘留物的鑒別和測定均有報道。

3．4生物大分子分析

lc-ms／ms可實現蛋白質的快速高靈敏度鑒別和測定，蛋白質酶解后，產生多個肽段，經過lc分離，用ms／ms可獲得肽的質量譜，因此可對肽段進行鑒別和測定；通過蛋白質序列數據檢索，可得出蛋白質序列信息。利用lc-ms／ms還可以開展dna-藥物結合態分析，肽及蛋白質與金屬離子配位研究等。

4展望

與已成熟的gc—ms聯用技術相比較，lc-ms／ms聯用技術還處于初期發展階段，它的應用才剛剛起步。但lc-ms／ms所具備的一系列優點，決定了它的應用前景比gc-ms更為廣泛。在“接口”方面，api接口的成功應用，使得液-質聯用成為可能。在對大分子和小分子化合物分析中，展現了它作為通用接口的廣闊應用前景。采用api nanospray接口。適合于分析超微量的樣品，如生化樣品或法醫樣品，靈敏度可高達fmol，能夠實現微徑hplc與質譜的聯用，這是近來的一個發展趨勢。

在串聯質譜方面，目前以四極桿串聯質譜為主，它可進行ms1和ms2操作(空間上)。離子阱質譜和富利葉變換質譜(ft—icr—ms)亦可完成多級串聯質譜分析(時間上)，離子阱質譜通過改變阱里射頻場最多可進行10級ms操作，ft-icr-ms通過離子回旋共振進行多級ms操作。飛行時間質譜(tof)作為第二個質量分析器，由于其分辨率高、質量范圍寬、掃描快和靈敏度高等優點，成為一個重要的發展方向。

lc-ms／ms聯用技術愈來愈多地受到人們的重視，一些國際著名的分析儀器公司和研究機構建立多個研究實驗室參于研究開發。總之，為應用目的而建立的lc-ms／ms聯用技術會越來越多，應用研究課題也會越來越多。