HPLC法對豬體內金霉素的殘留檢測

　【摘要】  目的  了解飼喂金霉素后藥物在豬體內的殘留情況。方法  應用高效液相色譜儀測定豬部分組織中金霉素的含量，根據殘留量，確定臨床應用金霉素的休藥期。結果  HPLC法穩定性好，測量精度高，最高回收率達87.8%，最低回收率達53.6%。結論  連續5天以600ppm劑量飼喂豬的安全休藥期為27天。

　　【關鍵詞】  金霉素；高效液相色譜；豬；殘留

　　HPLC detection of residual in swine afcer fed chrysomycin

　　CHEN Zhi-bao，WANG Wei-na，HUANG Da-peng，et al.Life College of 81 Farming University，Heilongjang 163319，China

　　【Abstract】  Objective  This study was to get the message of the residual in swine after they were fed chrysomycin. Methods  The HPLC was used to determine the content of chrysomycin in part organism of swine，based on the residue level to definite the drug holiday of clinical application of chrysomycin. Results  HPLC had good constancy and high measurement precision. The highest recovery rate could reach 87.8%，and the lowest recovery rate could reach 53.6%.Conclusion  Using of 600 ppm dosage to feed the swine in successive 5 days，the safe drug rest was 27 days.

　　【Key words】  chrysomycin; HPLC; swine; residual

　　四環素類(TCS)藥物是一類廣譜抗生素。隨著畜牧業的發展，其作為飼料添加劑被廣泛應用［1］。但在畜牧生產上由于不合理應用(用量過大或時間過長)，導致動物組織中(如肌肉、肝、腎等)四環素類藥物的殘留量過大，影響我國的出口貿易，以及食用這些含有殘留的動物性食品后會給人體健康帶來某些影響［2］。

　　本試驗是研究用高效液相色譜法［3］來檢測豬組織中金霉素藥物的殘留量。根據殘留量，確定臨床應用金霉素的休藥期，為合理應用金霉素提供理論依據。實驗結果如下。

　　1  材料與方法

　　1.1  藥物  金霉素，河南駐馬店華中正大有限公司，15%的金霉素，批號0407155，商品名：喜特肥。

　　1.2  實驗動物  90～110kg育肥豬。

　　1.3  豬的飼養、用藥及樣品采集：分別給40頭豬，飼喂添加600PPM金霉素飼料［4］，連喂5天。分別于用藥后第1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33天，每次屠宰2頭豬，采集每頭豬的臀部肌肉、肝臟、腎臟組織樣品（臀部肌肉100g，肝臟50g，腎臟50g），將所采樣品的日期和名稱進行標記并于-20℃冷凍保藏，待測。

　　1.4  儀器  高效液相色譜(HPLC)儀：SIB810型泵、SP8450型UV檢測器；反相C-18柱；微量進樣器(25μl)  (美國光譜物理公司)；YQ-3型電動勻漿機(江蘇江陰科研器械廠)；LD4-2A離心機：4500r／min(北京醫用離心機廠)；旋渦混合器：WH361型(江蘇太倉鹿河生化儀器廠)。

　　1.5  試劑  所用甲醇為重蒸過濾甲醇；水為重蒸餾水。乙腈 (色譜純);甲醇，乙酸銨，檸檬酸，依地酸二鈉 (分析純);磷酸氫二鈉，磷酸氫二銨，草酸銨(分析純);草酸(分析純);三氟乙酸 (進口) ( Art．808260);N，N?二甲基甲酰胺(分析純);鹽酸金霉素標準品(進口) (純度84％) (SIGMA公司);鹽酸土霉素標準品(進口) (900μg／mg ) (SIGMA公司)。

　　1.6  流動相  甲醇/乙腈/0.01 mol／L草酸(1.5/1.5/2.0 pH=2.0)。

　　1.7  樣品的提取與測定  用pH=4.0的MCI／Vaine／Na2EDTA緩沖液將金霉素藥物從樣品中提取，過濾后通過C-18微柱水洗后，用草酸甲醇將藥物洗脫，洗脫液用高效液相色譜儀進行測定。

　　1.8  HPLC測定工作條件  流速：1.8ml／min。柱溫：室溫。檢測波長：350nm。AUFS：0.002。衰減AT=4。進樣量：10μl。紙速：CS=0.25cm／min。

　　2  結果與分析

　　2.1  標準曲線測定結果  金霉素標準曲線：測定結果見表1，根據表中數據求得其回歸方程為：金霉素(mg／kg)=平均峰面積*0.7482+0.0380，相關系數=0.9979。表1  金霉素標準曲線測定結果

　　2.2  回收率的測定結果  添加一定量的相應標準液于豬肉勻漿組織中，提取后進行測定，流動相與流速同標準曲線測定。金霉素在肉豬組織中的回收率最低為53.6％，最高達87.8％。

　　2.3  豬不同組織、不同給藥時間金霉素含量的測定結果  豬不同組織、不同給藥時間金霉素含量的測定結果見表2，由表2可知，應用金霉素后，豬組織中金霉素殘留量基本呈線性關系，符合藥物代謝規律。表2  豬不同組織、不同給藥時間金霉素含量的測定結果

　　3  討論

　　3.1  色譜條件的選擇  改用流動相：甲醇／乙腈／0.01 mol／L草酸(pH=2.0  1.0：1.5：2.5)對標準液TC進行測定，結果較理想，能繪制了TC的標準曲線，由于資料報道［5，6］的流動相：甲醇／乙腈／0.01mol/L草酸比例為1.0：1.5：2.5，據本實驗儀器實際情況，把流速2.0ml/min改為1.5ml/min或1.8ml/min，這樣出峰時間晚，在與其實驗標準峰形比較時，不宜確定所出的峰是否為金霉素的峰。因此改變流動相的比例為：甲醇/乙腈/0.01 mol/L草酸(1.5：1.5：2.0)，并在以后的標準曲線制作中一直采用此流動相及其比例。

　　3.2  回收率的測定

　　3.2.1  提取過程中，洗脫液的選擇：提取過程中，用6.0ml甲醇草酸(0.01 mol/L)進行洗脫，曾用混合樣品做試驗，用0.2mol/L檸檬酸鈉混入洗脫液中(0.2mol/L檸檬酸鈉占1/5～1/100作洗脫液)，回收率有所提高，但混合樣品分離不好。選用本實驗所用的0.01mol/L草酸甲醇的效果較好，可見洗脫液的選擇還可進一步研究。

　　3.2.2  提取過程中，許多操作需不斷摸索。從提取液MCI／Vaine／Na2EDTA的體積、離心的轉速、離心時間到抽濾泵的壓力乃至洗脫的流速和時間等［7，8］，在操作過程中各種因素不同都可能造成回收率的偏低。因此，提高金霉素藥物殘留回收率和檢測限，需認真操作每一步驟。

　　3.3  金霉素為常用抗菌、促生長飼料添加劑，應用范圍很廣。肉品中過高的金霉素殘留，對人的健康十分有害，各個國家和地區都對金霉素殘留制訂一定的標準。根據“歐盟”及“供港食品”標準的規定，金霉素在豬肌肉、肝臟、腎臟組織的殘留量分別為0.1mg/kg、0.3mg/kg、0.6mg/kg。表3中，在用藥后25天，肌肉和肝臟組織的殘留已達到此下限，而腎臟23天時就達到標準，考慮到檢測過程中的回收率問題，金霉素的準確休藥期定為27天更為合理。