HPLC檢測食品中L抗壞血酸、D異抗壞血酸及抗壞血酸總量

維生素C(又稱L-抗壞血酸,化學名L-3-氧代蘇己糖醛酸內酯),是一種天然存在的具有抗氧化性質的有機化合物,亦是一種維持人體正常活動不可缺少的營養物質。L-抗壞血酸分為還原型和脫氫型兩種,其中還原型L-抗壞血酸極不穩定,遇空氣中氧、熱、光、堿性物質,特別是在有氧化酶及痕量銅、鐵等重金屬離子存在時,易被氧化成為脫氫L-抗壞血酸。L-抗壞血酸作為一種營養強化劑和食品添加劑廣泛應用于食品加工和保健品行業中[1]。D-異抗壞血酸是L-抗壞血酸同分異構體,化學性質與L-抗壞血酸相似,抗氧化性較L-抗壞血酸佳,但生理活性極低,僅有L-抗壞血酸的1/20。D-異抗壞血酸作為食品抗氧化劑和肉制品的防腐助色劑,以及藥品的輔助材料,應用于肉類罐頭,啤酒,果汁果醬,冷凍水產品等食品中。但攝入過多也會使白細胞的抗病能力明顯下降,會引起草酸及尿酸結石、腹瀉、多尿、皮疹等。目前國內測定抗壞血酸的常見方法主要有熒光法、比色法和滴定法。熒光法操作繁瑣且熒光讀數不穩定;2,4二硝基苯肼比色法,易受試樣雜質和顏色干擾,誤差較大,且使用腐蝕性試劑硫酸和易爆試劑;滴定法易受深色樣品的顏色干擾,靈敏度低,誤差較大。而這些方法均只能測定食品中天然存在的或添加的抗壞血酸總量,無法分別測定同時存在的L-抗壞血酸和D-異抗壞血酸[2~4]。近年來,國內外有學者研究高效液相色譜(HPLC)檢測抗壞血酸,成為了重要的研究方向和發展趨勢[5~7],本文建立了一種簡單快速、準確有效的HPLC技術,同時檢測多種食品基質中L-抗壞血酸、D-異抗壞血酸及抗壞血酸總量。圖1 L-抗壞血酸、D-異抗壞血酸和脫氫抗壞血酸結構式1材料與方法1.1材料與試劑L-抗壞血酸標準品,D-異抗壞血酸標準品(純度99.7%以上,Supleco);偏磷酸,磷酸三鈉,磷酸二氫鉀,磷酸(分析純,國藥集團化學有限公司);L-半胱氨酸,十六烷基三甲基溴化銨(優級純,Supleco);甲醇(色譜純,Caledon)。偏磷酸溶液(20 g/L):稱取20 g偏磷酸,溶于水定容至1 L。磷酸三鈉溶液(100 g/L):稱取100 g磷酸三鈉,溶于水定容至1 L。L-半胱氨酸溶液(40 g/L):稱取20 g L-半胱氨酸,溶于水定容至500 ml,臨用時配制。1.2儀器與設備Agilent 1200高效液相色譜儀,附二極管陣列檢測器或紫外檢測器;pH計(Professional Meter PP-50,Sartori-us);離心機(5810R,Eppendorf公司);超聲波清洗器(EYELA MVS-10)。1.3實驗方法1.3.1標準溶液配制L-抗壞血酸和D-異抗壞血酸標準儲備溶液(1.0 mg/ml):分別稱取L-抗壞血酸、D-異抗壞血酸標準品10 mg(精確至0.1 mg),用20 g/L的偏磷酸溶液定容至10 ml。臨用時配制。標準工作溶液的配制:分別吸取L-抗壞血酸和D-異抗壞血酸標準儲備溶液適量,用20 g/L的偏磷酸溶液逐級稀釋成0.5μg/ml,5.0μg/ml,10.0μg/ml,25.0μg/ml,50.0μg/ml的標準工作溶液。臨用時配制。1.3.2試樣溶液的提取稱取均質后的固體樣品2 g,或吸取液體樣品10 ml(含抗壞血酸約1 mg~3 mg)于50 ml離心管中,用20 g/L的偏磷酸溶液定容至50 ml,振蕩后超聲提取15 min,4000 r/min離心5 min,經0.22μm水相濾膜過濾,供HPLC測定試樣中還原型L-抗壞血酸和D-異抗壞血酸的含量。1.3.3試樣溶液的還原取20 ml試樣溶液于50 ml離心管中,加入10 ml 40 g/L L-半胱氨酸溶液,用100 g/L磷酸三鈉溶液調節pH至7.0~7.2,振蕩5 min,將脫氫抗壞血酸還原為還原型抗壞血酸。再用磷酸調節pH至2.5~2.8,用水定容至50 ml,即得試樣還原溶液。若試樣含有增稠劑,吸取4 ml的試樣還原溶液,加入1 ml甲醇混勻。試樣還原溶液經0.22μm水相濾膜過濾,供HPLC測定抗壞血酸總量。樣品盡可能在25℃以下、避光的環境中,于8 h內完成檢測。1.3.4 HPLC色譜條件色譜柱:Kromasil C18柱,250 mm×4.6 mm,5μm;檢測器:二極管陣列檢測器或紫外檢測器;流動相:A:6.8 g磷酸二氫鉀,0.91 g十六烷基三甲基溴化銨,溶解在1 L水(pH2.5~2.8)中,B:100%甲醇,A+B(98+2);流速:0.7 ml/min;檢測波長:245 nm;柱溫:25℃;進樣量:10μl。2結果與分析2.1 pH值對抗壞血酸還原的影響吸取1.0 mg/ml的L-抗壞血酸標準儲備溶液2.5 ml于50 ml離心管中,加入10 ml 40 g/L的L-半胱氨酸溶液,用100 g/L磷酸三鈉溶液調節不同pH值,測定其還原率(表1)。結果表明磷酸三鈉溶液調節pH至7.0~7.2時,L-半胱氨酸的還原效果最好。表1 pH值對抗壞血酸還原效率的影響pH值6.5 7.0 7.2 7.5 8.0 9.0還原率(%)39.1 72.3 72.4 60.5 46.5 30.82.2振蕩反應時間對抗壞血酸還原的影響吸取1.0 mg/ml的L-抗壞血酸標準儲備溶液2.5 ml于50 ml離心管中,加10.0 ml 40 g/L的L-半胱氨酸溶液,用磷酸三鈉溶液調節pH至7.0~7.2,通過振蕩反應時間的不同,測試抗壞血酸的還原效率。結果表明振蕩反應時間對還原效果的影響不大,振蕩反應5 min就能夠滿足試驗要求。2.3流動相的選擇實驗發現,流動相配比隨著甲醇濃度的降低,L-抗壞血酸和D-抗壞血酸兩峰分開,當甲醇比例為2%時,L-抗壞血酸和D-抗壞血酸兩峰達到基線分離。而流動相pH值在4.0~7.0時,無法提供一個穩定的酸性環境,L-抗壞血酸和D-異抗壞血酸的出峰時間易發生漂移。流動相pH值調整在2.5~2.8時,抗壞血酸出峰時間時間穩定。圖2 L-抗壞血酸和D-異抗壞血酸標準溶液色譜圖(0.5μg/ml)2.4標準曲線及線性關系L-抗壞血酸和D-異抗壞血酸在0.5μg/ml~50μg/ml范圍內均有良好的線性關系。L-抗壞血酸線性回歸方程為y=16.24x-1.399,相關系數r=0.9999。D-異抗壞血酸線性回歸方程為y=18.06x-4.34,相關系數r=0.9999。2.5加標回收和精密度實驗對六種不同基質的試樣進行添加回收試驗,準確度和精密度結果見表2。表2食品中抗壞血酸測定的加標回收和精密度(n=6)樣品本底值mg/100 gL-VC D-VC添加水平mg/100 gL-VC D-VC平均回收率(%)L-VC D-VC相對標準偏差RSD%L-VC D-VC乳粉1.750 ND 3.125 3.125 107.1 88.8 3.67 1.3731.25 31.25 97.6 91.7 1.28 1.35312.5 312.5 99.0 104.7 1.79 0.79肉干ND ND 3.125 3.125 92.4 87.5 4.64 4.7831.25 31.25 92.8 101.8 2.57 2.95312.5 312.5 96.4 101.1 3.15 3.08麥片1.569 1.731 3.125 3.125 109.3 91.4 4.67 7.0031.25 31.25 91.4 94.0 1.04 2.98312.5 312.5 94.9 103.9 0.20 1.46果汁0.279 ND 0.625 0.625 105.8 110.8 2.61 4.786.25 6.25 98.9 100.2 4.44 4.6162.5 62.5 96.2 97.2 0 0.99維生素片0.963 1.188 3.125 3.125 93.6 84.4 5.21 2.6231.25 31.25 93.7 90.6 2.79 0.60312.5 312.5 96.5 96.4 1.14 0.61蔬菜泥0.942 0.888 3.125 3.125 99.1 93.7 5.61 3.4931.25 31.25 102.0 92.8 3.32 2.37312.5 312.5 96.1 99.8 0.67 0.99注:ND:未檢出。2.6檢出限測定以信噪比(S/N)3作為檢出限(LOD),固體樣品的檢出限為0.938 mg/100 g,液體樣品的檢出限為0.188 mg/100 g;以信噪比(S/N)10作為定量限(LOQ),固體樣品的定量限為3.125 mg/100 g,液體樣品的定量限為0.625 mg/100 g。2.7實際樣品測試利用建立的高效液相色譜法,對配方奶粉、嬰兒輔助食品粗麥奶糊粉、酸奶糊、天然維生素片進行還原型L-抗壞血酸,D-異抗壞血酸和抗壞血酸總量的測試,測定結果與樣品標簽值進行對比(表3,圖3)。結果表明,四種食品標簽上的維生素C含量與還原型L-抗壞血酸的含量更接近。表3還原型L-抗壞血酸,D-異抗壞血酸和抗壞血酸總量測定結果(mg/100 g)還原型L-抗壞血酸還原型D-異抗壞血酸抗壞血酸總量標簽值配方奶粉74 ND 81 72粗麥奶糊粉39 ND 49 42水果酸奶糊35 ND 41 30維生素片15300 ND/15000注:“ND”代表“未檢出”。圖3乳粉中還原型L-抗壞血酸和L-抗壞血酸總量的圖譜3結論本文建立了食品中L-抗壞血酸、D-抗壞血酸及抗壞血酸總量的高效液相色譜(HPLC)檢測技術,具有簡便、快速、靈敏度高的優點,適用于乳粉、谷物、水果、蔬菜及其制品類、肉類和保健食品等多種基質,固體樣品的定量限為3.125 mg/100 g;液體樣品的定量限為0.625 mg/100 g,能夠滿足我國及不同國家的法規要求。HPLC檢測食品中L-抗壞血酸、D-異抗壞血酸及抗壞血酸總量@張秀芹$上海出入境檢驗檢疫局!上海200135 @王敏$上海出入境檢驗檢疫局!上海200135 @顧瑩$上海出入境檢驗檢疫局!上海200135 @周瑤$上海出入境檢驗檢疫局!上海200135 @曲栗$上海出入境檢驗檢疫局!上海200135 @陳迪$上海出入境檢驗檢疫局!上海200135 @韓麗$上海出入境檢驗檢疫局!上海200135 @倪昕路$上海出入境檢驗檢疫局!上海200135 @朱堅$上海出入境檢驗檢疫局!上海200135目的建立食品中L-抗壞血酸、D-異抗壞血酸及抗壞血酸總量的高效液相色譜法。方法試樣經偏磷酸溶液超聲提取后,液相色譜法直接測定還原型L-抗壞血酸和D-異抗壞血酸;加入L-半胱氨酸溶液,將脫氫抗壞血酸還原為還原型抗壞血酸后測定L-抗壞血酸總量。流動相為磷酸二氫鉀-十六烷基三甲基溴化銨-甲醇(pH2.5~2.8);檢測波長245 nm,外標法定量。結果 L-抗壞血酸和D-抗壞血酸在0.5μg/ml~50μg/ml范圍內線性關系良好;平均添加回收率為84.4%~110.8%,RSD<7.00%(n=6);固體樣品的定量限為3.125 mg/100 g,液體樣品的定量限為0.625 mg/100 g。結論該方法簡便、快速、準確,能夠檢測食品中L-抗壞血酸、D-異抗壞血酸及L-抗壞血酸總量。高效液相色譜(HPLC);;L-抗壞血酸;;D-異抗壞血酸;;抗壞血酸總量