HPLC故障排除：保留時間問題（一）

發布時間：2020-04-13 15:06 原文鏈接： HPLC故障排除：保留時間問題（一）

可能致因

	預防措施/解決方案
減少保留時間
鍵合固定相的損失（流失）	更換柱（更換色譜柱）在pH值為2-8的硅基（硅膠基質）RP柱上操作
固定相上的（存在）活性基團	在流動相中使用有機改性劑增加緩沖強度（增加緩沖液離子強度）
增加流量（流速）	檢查并調整泵的流量（流速）
柱超載（色譜柱過載）	減少注入的樣本量（減小進樣量）使用具有更大內徑的柱（色譜柱）
延長保留時間
改變流動相的成分	覆蓋溶劑容器（蓋緊溶劑瓶）制備新的流動相
鍵合固定相的損失（流失）	更換柱（更換色譜柱）
減少流量（流速）	檢查并調整泵的流量（流速）檢查系統是否存在泄漏，包括泵的密封（泵密封圈）
流動相中存在氣泡	檢查流量和壓力對流動相脫氣（流動相脫氣）
波動保留時間
柱平衡（色譜柱平衡時間）不足	在運行之間（在兩次進樣之間用更長時間）充分平衡柱用濃縮樣品調整色譜柱
流動相成分的變化	檢查流動相的成分，必要時補充新的成分（新配流動相）檢查比例閥的準確度
緩沖能力不足	使用> 20mM的緩沖液濃度
波動柱的溫度（柱溫波動）	穩定的（穩定）室溫保持柱恒溫

2. 保留變量（時間變動）

如果所有峰（色譜峰）的保留時間均發生了變化，其致因很可能是如下因素發生了變化：流動相的組成、色譜柱的化學性質、色譜柱的溫度或流速。

如果等度或梯度流動相在在線式混合中出現錯誤，也可能導致保留時間出現問題。

下面將簡要介紹這些問題來源（對上述每個原因都簡述如下）。

2.1.如果操作人員操作不當，則會導致流動相組成的意外變化，例如使用在線式混合系統時，流動相混合物（系統）設置不正確；或替換新批次流動相時，未妥善制備新的流動相（新流動相配制不正確）。

在極少數情況下，會出現流動相組分選擇性損失的情況，例如蒸發。
當流動相發生變化時，峰形（色譜峰）通常會向相同的方向移動，以縮短或延長保留時間（保留時間變長或變短）；而相對保留（選擇性因子，a）通常會發生變化。

檢查流動相組成錯誤的最佳方法是仔細檢查（復查）系統設置；如有必要，應制備新的流動相。

方法文件應包含特定流動相變化影響的相關信息。例如，有機溶劑或pH值的微小變化會對色譜圖產生特征（在色譜圖體現出特征性的）影響，如分辨率或保留的變化（分離度的變化或保留時間的漂移）。

如果您懷疑設備出現故障，請將色譜柱和流動相移至另一個HPLC系統，然后再次運行。

如果問題依然存在，則問題在于流動相或色譜柱；如果問題不再出現，則可能與其他系統組件或參數相關。

2.2.色譜柱化學（化學性質）變化會在色譜柱的整個生命周期內出現，并且一般會在數周或數月內逐漸變化。柱老化一般伴隨著柱背壓的上升、保留時間的逐漸變化（漂移）（更長或更短）以及更多的峰拖尾。

更換新柱以確定是否是柱老化導致的問題（可確證色譜柱老化）。

500-2000次注射（進樣）的柱壽命是較為理想的；在這一點上，柱成本相較于整體分析，是十分微小的，所以更換新柱的可行性較高（色譜柱在整個分析的成本中所占比例低，因而可以合理更換色譜柱）。

如果色譜柱的使用壽命過短，應仔細檢查操作條件，以確保它們適用于該色譜柱。

圖5顯示了在極端操作條件下，色譜柱壽命較短的示例（縮短的壽命）