DNAmicroarray相關的基因表達數據處理攻略

基因表達譜 的發展有助于科研工作人員進一步的理論知識充實及應用到研發等領域中。基因芯片是最近幾年發展起來的基因表達重要工具，本文主要對這種技術的數據分析和管理方法作具體介紹。

一、引言

DNA微陣列(DNA microarray),也叫基因芯片，是近幾年發展起來的一種能快速、高效檢測DNA片段序列、基因型及其多態性或基因表達水平的新技術。它將幾十個到上百萬個不等的稱之為探針的核苷酸序列固定在微小的(約1cm2)玻璃或硅片等固體基片或膜上，該固定有探陣的基片就稱之為DNA微陣列。它利用核苷酸分子在形成雙鏈時遵循堿基互補原則，可以檢測出樣本中與探陣陣列中互補的核苷酸片段，從而得到樣本中關于基因結構和表達的信息。它的技術來源追溯到一個多世紀之前，Ed Southern發現被標記的核酸分子能夠與另一被固化的核酸分子配對雜交 。

因此，Southern blot可被看做是最早的基因芯片。在八十年代，Bains W.等人就將短的DNA片斷固定到支持物上，借助雜交方式進行序列測定。1995年，斯坦福大學開發出第一片cDNA芯片并用于生命科學研究，1998年美國Affymetrix公司將第一片帶有13.5萬個基因探陣的寡聚核苷酸芯片推向市場，標志著DNA微陣列的產業化，從此基因芯片或DNA微陣列的研究和應用得到了廣泛的重視，可以說在生命科學研究界和產業界掀起了基因芯片熱潮，1999年Nature出專刊介紹這門基因芯片及其應用。

基因芯片可用于DNA序列的再測序、基因SNP或多態性檢測和基因表達分析。由于基因芯片技術是一種高通量檢測技術，它可是并行的同時檢測成百上千，甚至成千上萬個基因的活動情況或DNA片段，改變了傳統的每次只能檢測一個基因的情況，因此能大大提高檢測效率，降低檢測成本，并保證了檢測質量。

基因芯片技術可廣泛應用于疾病診斷和治療、藥物篩選、農作物的優育優選、司法鑒定、食品衛生監督、環境檢測、國防、航天等許多領域。它將為人類認識生命的起源、遺傳 、發育與進化、為人類疾病的診斷、治療和防治開辟全新的途徑，為生物大分子的全新設計和藥物開發中先導化合物的快速篩選和藥物基因組學研究提供技術支撐平臺。

通過基因表達譜的研究可以進行進一步的理論研究或應用研究。

1、理論研究。根據基因組基因表達譜可以進一步分析共表達基因是否存在共同的順式調控元件，發現新的調控元件。此外，可以研究基因的調控規律，構建調控網絡。

2、應用研究包括疾病診斷和藥物開發。根據不同疾病狀態下的差異表達譜的研究可以確定疾病的類型和進展。研究藥物作用后基因表達譜的改變可以確定藥物的毒性、預后和療效，從而指導藥物開發和臨床合理用藥。

在基于DNA微陣列的基因表達分析研究中，數據的分析和管理是一個關鍵性的問題，它直接影響了實驗結果的準確型和實驗的可靠性。

二、數據分析

數據的分析包括了三個部分：芯片圖像處理獲得單次實驗的基因表達水平;整合多次實驗得到基因表達矩陣;根據基因表達矩陣進行知識挖掘。下面簡單介紹一下其中涉及的關鍵技術：包括歸一化和聚類分析。

歸一化對于cDNA微陣列技術，包含Cy3和Cy5兩個通道，通常存在兩個通道熒光亮度不平衡的問題，Cy3的亮度低于Cy5[Quackenbush, 2001]。歸一化的目的是平衡實驗過程中Cy3與Cy5兩個通道的相對熒光亮度。

它基于如下的假設：芯片上的所有的基因，一組基因子集或一套外源的控制在標記前產生RNA，其平均表達率等于1。使用歸一化因子調整數據，彌補實驗的變化，“平衡”待比較的兩個樣本的熒光信號。主要有3種被廣泛使用的技術用于來自同一個芯片雜交的基因表達數據的歸一化。

1、總亮度歸一化

總的亮度歸一化數據依賴于假設：兩個標記的樣本的起始量是一樣的，此外，假設一些基因在待檢測的樣本中相對于控制樣本是上調的，另外一些是下調的。對于芯片上成百上千或成千上萬的基因，這些變化應該是平衡的，因此，總的與芯片雜交的RNA的量是一樣的。因此，芯片上所有的元素計算得到的總的累加亮度在Cy3和Cy5通道上是一樣的，在這種假設下，計算歸一化因子，并用于芯片上每個基因的亮度比例計算。

2、用回歸技術歸一化

對于起源于相關樣本的mRNA，被分析的基因的顯著性分數在相似的水平上被表達。在Cy5與Cy3亮度(或對數值)的散點圖上，這些基因沿著直線聚類，如果兩個樣本標記和檢測效率是一樣的則該斜率將是1。這些數據的歸一化等于用回歸技術計算它的最合適斜率，調整各基因熒光亮度使計算得到的斜率為1。在許多實驗中，亮度是非線性的，使用局部回歸技術更合適，例如LOWESS(局部權值散點圖平滑)回歸。

3、使用比率統計歸一化

Chen描述的基于比率統計的歸一化方法。假設盡管在緊密相關的細胞中，單個基因可以上調或下調，RNA產生的總量與重要的基因近似相等，例如看家基因。基于這種假設，他們發展了一種近似概率密度比率Tk=Rk/Gk(R,G分別代表第k個元素的測量的紅/綠亮度比)然后他們用于迭代過程，歸一化平均表達率為1，計算可信度閾值用于識別差異表達的基因。

除了以上三種在應用中被廣泛使用的除外，還有一些復雜的、非線性的方法用于歸一化。歸一化后，每個基因的數據以表達率或表達率的對數報告。應用對數值的優點是理解更簡單，如果值大于0，則表示該基因的表達率大于1，反之小于1。

對于合成寡聚核苷酸微陣列不存在cDNA微陣列熒光不平衡導致的系統歪曲的問題，但是對于相比較的兩組實驗來說，需要用兩塊芯片與兩個樣本雜交兩次，產生的原因包括兩個樣本中mRNA數量的差異或用于標記樣本的染料的質量不同，都可能導致錯誤。在這里歸一化的目的也是去除這些錯誤。

聚類分析

通過圖1的數據獲取過程，可以得到細胞的基因表達矩陣。基因的表達矢量定義為每個基因在表達空間的位置。用基因表達的觀點看，每個實驗在空間中表達一個隔離的和不同的軸，在該實驗中的基因的測量值log2(比率)代表了幾何坐標。

例如，如果我們有三個實驗，對于一個給定的基因在實驗1種的log2(比率)值是它的x坐標，在實驗2中的值是y坐標，在實驗3中的值是z軸，因此，我們能表示所有的信息，一個基因在x-y-z表達空間中用一個點表示。第2個基因，對于每個實驗近似相同的值(log2(比率))將在表達空間中空間相近的點表示。不同表達模式的基因將于最初的基因離的較遠。

對于更多的實驗這種推廣是直接的(盡管很難畫出)，表達空間的維度的增加與實驗的數目相等。用這種方式，表達數據可以表示為n維表達空間，n是實驗的數目，每個基因表達矢量表示為該空間內的單個點。

有了測量基因間距離的方法后，聚類算法根據在表達空間中的分離度選擇基因和將基因分組。需要提及的是如果我們感興趣聚類實驗，我們將每個實驗表示為一個實驗矢量，包括每個基因的表達值。這里定義的實驗空間，維度等于每個實驗中分析的基因數目。同樣的方法定義距離，我們能夠應用任何的聚類方法來分析和分組實驗。

為了解釋多個實驗分析的結果，直覺的可視化表示是很有幫助的。通常使用的方法依賴于表達矩陣的建立，矩陣的每一列表示單個實驗，每一行表示特定基因的表達矢量。根據表達數據用不同的顏色表示矩陣元素建立多個實驗的基因表達模式的可視化。表達矩陣有無數的方案來著色和表示。最常用的方法是根據每個實驗的log2(比率)值，log2(比率)等于0用黑色，大于零的用紅色表示，負數的用綠色表示。

對于矩陣中的每一個元素，相對亮度表示了相對表達水平，約亮的元素表示差異表達越大。對于任何特定的實驗組，表達矩陣通常沒有明顯的模式或順序。設計程序來聚類數據通常重組行、列或兩者。當以這種方式可視表示可以看到明顯的表達模式。

在聚類數據前，有兩個問題需要考慮：

1、數據需要用某種調整方式來增強某一種關系?

2、采用何種距離測量來分組相關的基因。

在許多微陣列實驗中，數據分析被具有最大數據值的變量決定，這樣掩蓋了其他重要的區別。為了避免這個問題，采用的一種方法是調整或重新確定數值范圍，使每個基因的平均表達為0，稱之為平均中心法過程。在這個過程中，基因的基本表達水平被每次實驗測量值相減。這樣增強了每個基因在每個實驗中的表達水平的變異，而不考慮基因是否是上調或下調。這種方法對于分析時間過程的實驗是特別有用的，可以發現在基礎表達水平周圍變異相似的基因。這些數據調整為-1~1之間的值。或者每個表達矢量的長度為1。

基因的聚類分析方法根據不同的描述包括：層次式與非層次式(k-means);分解法、合成法;有師(使用現有的生物學知識，關于功能相關的特定基因指導分類算法)、無師分析方法等。聚類分析技術非常有用，應該關注不同的算法、不同的歸一化或者不同的距離矩陣，將把不同的目標放在不同的類中，此外，不相關數據的聚類仍將產生類，雖然他們沒有生物學意義。因此基因表達分析方法的挑戰是針對特定的數據應用適當的方法，使數據明顯的分開。主要的無師聚類分析方法有層次式聚類法[Eisen,1998]、自組織神經網絡[Tamayo，1999] 、k平均法、模糊聚類法等，有師分類包括矢量學習機法[Brown，2000]等，此外還有主元分析法和利用統計學的SAM法等。

1、層次式聚類法(hierarchical clustering method)

這是多元統計分析中常用聚類方法，對于n個樣本構成的n個矢量，看作是n個類，先計算所有兩類之間的相似性關系，將相似關系最近的兩類生成一個新類，繼續以上過程，直到最后只有一個類為止。在這個過程中每次形成一個新類，類的數目間減少一個，最后形成一棵樹，反映樣本之間的相似關系。

在計算新類與其它類的相似關系時有不同的方法，有最小距離法、最大距離法、平均距離法、重心法、離差平方和法等。如最小距離法是將組成新類的兩個類分別與第三個類相似關系最近的值為新類和第三個類之間的相似關系。該類方法可以直觀的反映基因之間的關系，而且計算速度快，但使用不同的類間距離計算法會產生不同的聚類結果，而且對于一個樣本被分類后，就不能再參與分類，因此它不能將所有的數據作為一個整體進行分析，是一個局部決策的方法。同時當樣本集非常大時，樹型結果非常復雜，樹的剪枝和類的確定比較模糊。

最簡單、結果可視。是用于分析基因表達數據用得最多的方法，它是一種合成分析的方法，單個基因被連接形成組，繼續直到形成單棵層次樹。對于基因表達數據，平均連接聚類給出可接受的結果。主要問題是隨著類數目的增加，表達某一類的表達矢量也許不再表示類種的任何成員。此外，與最初的基因順序有關。

2、自組織神經網絡法(SOM,self-organizing map)

自組織映射是Kohonen，T提出的類似大腦思維的一種人工神經網絡方法，是一種競爭學習算法，可以被看作是一種將N維模式空間各點到輸出空間少數點的映射。這一映射由系統本身完成，沒有外部的監督，即聚類是以自組織的方式實現的。SOM采用無教師學習訓練，訓練完成后，分類信息存儲在權值向量中，具有與權值向量相似的輸入向量將分為一類。

包括1維和2維SOM，2維SOM也稱為KFM(Kohonen Feature Mapping)。它們的區別在于KFM考慮鄰近神經元的相互作用，即獲勝神經元對周圍神經元由于距離的不同會產生不同的影響。聚類結果與k平均法相仿，它的優點是自動提取樣本數據中的信息，同時也是一種全局的決策方法，缺點在于必須實現設定類的數目與學習參數，而且學習時間較長。

3、模糊聚類法(Fuzzy Clustering method)

模糊聚類是模擬人類的思維方法，通過隸屬度函數來反映某一對象屬于某一類的不確定程度[15]，從而建立起樣本對于類別的不確定性的描述，準確反映樣本之間的關系。模糊聚類分析方法的基本原理是將模糊數學中的有關概念與方法引進聚類分析，通過建立模糊相似關系來生成模糊等價關系，進而產生不同的水平截集，得到對樣本的動態聚類結果。

由于動態聚類圖的建立，可以方便的獲取有明顯特征的類，并能看到類的擴展，清楚地反映了類之間的關系，這樣就克服了k平均法和自組織神經網絡法必須事先確定類數目的缺點;同時對于每個λ值，所有的基因都重新參與分類，所以模糊聚類分析方法具有全局性，這是層次聚類法所不具有的。

4、k-平均法

它先將樣本分成若干類，然后計算每類的中心矢量(每類樣本的平均值)，對于所有的樣本重新計算與各類中心矢量的距離，然后根據距離調整分類，得到新的聚類中心，再次重復該過程，直到能滿足一定條件為止。它是層次聚類法的很好的替代，其分類結果與SOM的聚類結果接近。主要問題是在聚類開始時必須指定類的數目。

5、主元分析法PCA(also called singular value decomposition)

主要思路是減少矢量的維數而不損失用于分類的信息。屬于多元統計分析中一種常用的方法，它通過矩陣轉換，有效的將對能對分類提供主要信息的參數提取出來，從而便于分析。

6、SVM(Support vector machine)方法

是機器學習的一種方法，它的最大的優點是用小樣本可以將樣本集分成若干類，但它需要一個學習的過程，通過學習確定核心機函數。

7、SAM(Significance Analysis of Microarrays)方法：

聚類分析雖然能發現一致的基因表達模式，但不能提供統計顯著性的信息，用SAM方法來研究那一些基因會在用于癌癥病人的致電離輻射療法中產生副作用。這個問題是，每一次細微改變分析方法，得到不同的基因，使用一個非常低的輻射劑量，需要挑選出真正細小的變化。來自微陣列數據分析的最大的困難是確定哪一個結果是顯著性的。SAM通過降低錯誤率和揭示哪一個基因被輻射影響解決了這個問題。

三、數據管理

DNA微陣列的應用，產生了大量的基因表達數據，現在有許多存儲這些數據的數據庫，通常與發表的論文結合起來，提供后來的研究者比較全面的信息。這些數據的共享、發布和再利用成為目前重要的研究內容。一些知名的研究機構如NCBI，EBI等正在試圖建立新的標準，建立一些公共的知識庫，如美國NCBI的Gene Expression Omnibus (GEO)，英國EBI的ArrayExpress,日本DNA數據銀行開發的基因表達庫CIBEX。目前有一些比較有名的基因表達數據庫：

ArrayExpress:

由EBI研究和開發。是基于基因表達數據的微陣列公共知識庫。支持MGED(microarray gene expression data)組開發的MIAME(the minimum information about a microarray experiment)的各種技術指標。目的主要存儲被很好注釋的數據。ArrayExpress基于MAGE-OM對象模型，用Oracle實現，當前包含多個基因表達數據集和與實驗相關的原始圖像集。

ArrayExpress數據庫接受MAGE-ML格式的數據遞交或者通過MIAMExpress的基于Web的數據注釋和遞交工具。ArrayExpress提供一個簡單的基于Web的數據查詢界面，并直接與Expession Profiler數據分析工具相連，可以進行表達數據聚類和其它類型的直接通過Web的數據發掘。將進一步開發多個實驗和數據庫間的交叉查詢。ArrayExpress數據庫中的數據將與所有相關的由EBI維護的或再線的數據庫相聯接。

Gene Expression Omnibus

為了支持基因表達數據公共使用和分發，NCBI啟動了GEO項目。GEO是一個基因表達和雜交陣列數據倉庫，同時作為獲取來自不同有機體的基因表達數據的在線資源。到2002年7月9日，數據倉庫中包含內容：Platforms:99個(114M)，

Samples 2170(1706M)，Serials 61。Platform關于物理反應物的信息，平臺類型如核酸、抗體和組織陣列和SAGE數據等的基因表達數據被接受、增加和歸檔作為公共數據集。Series是關于樣本集的信息，樣本間的相關和組織。

Stanford Microarray Database(SMD)

SMD存儲微陣列實驗的原始和歸一化數據和對應的圖像文件。另外，SMD提供數據獲取、分析和可視化的界面。自從2002年1月1日，到6月3日，新增加789個新的陣列。達到總數2375個。45篇不同的論文。

3D-基因表達數據庫(http://www.univie.ac.at/GeneEMAC/ )保存胚胎基因表達模式的三維模型和相關的使用GeneMAC方法根據系列組織學部分重建的形態學結構。

ArrayDB

軟件包，提供交互式用戶界面挖掘和分析微陣列基因表達數據，所有的分析表達數據來自微陣列實驗。

BodyMap

人和老鼠基因的表達數據銀行，在不同組織或細胞類型和不同時間。

Chip DB

可以根據基因分類、菌株、樣本和實驗查詢。

ExpressDB

是關系型數據庫包含酵母和大腸桿菌RNA表達數據，2000年10月，包含20m條來自眾多出版物和內部研究的信息。

GXD(the gene expression database)

老鼠的基因表達數據

HuGE Index(Human Gene Expression Index)

目的是提供全面的數據庫來理解人類基因在正常組織中的表達，現有19個組織59個樣本的數據庫

Yale Microarray Database (YMD)

多個實驗室和研究中心的合作項目，包括微陣列圖像的歸檔和通過查詢語句查找，伴隨著成百上千不同研究者的數據分析。

目前有幾個因素阻礙了微陣列數據的廣泛使用：

1、這是一個年輕的領域，僅僅是在最近才意識到需要識別數據的重要方面，以獲取更多的信息。

2、基因表達數據比序列數據要復雜的多，僅僅在有具體的關于實驗條件的描述時才是有意義的。與有機體的基因組相比，由細胞類型乘以環境條件一樣多的轉錄本。

3、比較基因表達數據是相當困難的，因為目前，微陣列并不是在任何客觀的個體上測量基因表達水平。事實上，大多數測量報告的僅僅是基因表達的相對變化，使用一個罕見標準化的參考樣本。

4、不同的微陣列平臺和實驗設計以不同的格式和單位產生數據，用不同的方式歸一化，所有這些使的這些數據的比較和集成是一種錯誤傾向的練習。

有許多實驗室建立了自己的數據庫，微陣列數據和論文用不同的格式在作者的網頁站點上發布，目前大多數公共數據沒有用足夠的材料進行注釋，供不同的獨立小組使用。事實上，通常不進行注釋。關于數據質量、可靠性和特定數據點可能的錯誤水平的所有細節被完全剝離了。例如，對于兩通道的微陣列數據，通常僅僅給出信號去除背景后的比例，沒有提示關于信號和背景水平的絕對信息，但是這些信息對于評價每一個基因表達的可靠性是很重要的。

有必要建立公共的微陣列數據倉庫得到了公認。它的功能包括提供支撐基于微陣列實驗的論文的數據的訪問。這樣的數據倉庫在建設中，例如NCBI的GEO,日本的DNA數據庫，和EBI開發的ArrayExpress,然而，那些必需的信息應該存在這些數據庫中是不清晰的，存儲原始的微陣列掃描圖像，或每一個陣列元素最終的值(如兩通道平臺的每一個點的綠/紅比率)是足夠的嗎?或者一些中間的數據，例如來自特定圖像分析軟件包的完整的輸出?與原始數據發布或歸一化的數據?實驗中的那些信息是必須的?微陣列元素必須被注釋使實驗結果更容易被理解。

數據庫中存儲的信息必須有特定數據庫或倉庫的功能決定。如果僅僅是發表論文的數據支撐，對于實驗的一些細節已經在論文中說明。建立論文與數據庫的訪問接口就行。這樣的系統不大可能是有效的和可擴展的，更重要的是非標準化數據庫的價值和使用是非常受限制的。例如，使用這些數據庫對于高通量的自動化的數據分析和挖掘是非常困難的。過去幾十年序列數據庫的經歷證明了在數據產生的早期階段應用的結構和一致的注釋的策略是很重要的。

對于微陣列實驗相關的數據至少有三個層次：1、掃描圖像(原始數據)，2、圖像分析過程得到的定量輸出(微陣列定量矩陣);3、實驗結果(基因表達數據矩陣)。來自微陣列研究的數據和注釋必須滿足一下要求：

1、關于實驗的信息應該足夠解釋該實驗，必須有足夠詳細的說明來與相類似的實驗進行比較，允許實驗的重復。

2、信息必須以某種方式結構化，保證有效的查詢和自動化的數據分析和挖掘。

目前在基于微陣列的基因表達數據管理的主要成果是MIAME和MAGE-ML。

MIAME(the minimum information about a microarray experiment):

由微陣列注釋工作組開發。目的是描述對于明白解釋微陣列數據所必需的最少的信息，隨后可以獨立的驗證這些數據。MIAME不是微陣列實驗必須遵循的教條，而是一組指導方針，它將幫助微陣列數據庫和數據分析工具的開發。MIAME中包含的信息如圖2所示。

圖2 MIAME的結構表示

MAGE-ML：

微陣列基因表達標記語言是一種語言，用來描述和基于實驗的微陣列信息的通訊，它基于XML，可以描述微陣列設計、微陣列制造信息，微陣列實驗組織和實施信息，基因表達數據和數據表達結果。MAGE-ML直接自動來自MAGE-OM, 后者是使用UML開發和描述——描述對象模型的標準語言。首先使用圖形化表示法描述不同實體間的相互關系，比DTD更容易。然后，UML圖表主要是針對人的，而DTD是面向計算機的。因此MAGE-OM可以認為是初級模型。

這兩個標準已被許多大的基因芯片研究和制造機構采用，可以預言它們很可能將成為一種該領域的一個標準。

小結與展望

隨著DNA微陣列技術的完善和在生命科學研究中的廣泛應用，產生了大量的基因表達數據，這些數據中蘊含著大量的信息，如基因調控規律的信息，不同條件下表達差異的信息等等，利用這些信息可以進行基因啟動子區域順式調控元件的研究、基因表達調節途徑或網絡的研究、疾病或藥物作用特異表達譜的研究等等。數據的增多直接帶來的兩個問題是數據的管理和知識發現。

數據的管理主要通過建立數據庫的方式，目前已由較大的數據庫服務器，這些數據間的共享和再利用迫切需要建立某種標準，從而提高利用效率，MIAME和MAGE-ML在這方面作了有益的嘗試，有望成為一種規范。知識發現是從海量的數據中獲取有生物學意義的信息，并形成新的生物學知識。在這方面的研究還處于初始階段，最常采用的是統計學方法，如聚類分析、SAM等，但發展速度很快，目前已有大量的研究論文和分析軟件。

目前，DNA微陣列尚屬一個正在蓬勃發展中的年輕領域，這一方面雖然有不少科研工作成果，但總體上還遠遠不夠，有不少因素阻礙了數據的分析和管理的發展，需要相關的工作人員進一步的努力，本文若有不足之處，還望指正。