DNA測序技術（非同位素銀染測序系統操作技術與T7DNA聚...

3、質粒膜板制備：參照第一章所述的方法。

（二）超螺旋質粒DNA 的堿變性：

1、取4mg（約2pmol）超螺旋質粒DNA 至一eppendorf管中，加無離子水到終體積18ml。

2、加2ml 2mmol/L NaOH/2mmol/L EDTA 溶液，置于室溫(25℃下）保溫5分鐘。

3、加2ml 2mol/L NaAc溶液(pH4.6)渦旋混勻，使之中和。

4、加75ml無水乙醇，充分混勻后，置于干冰或-70℃沉淀10分鐘。

5、于12000g離心10分鐘，棄去上清，用200ml預冷的70%乙醇洗沉淀后，干燥沉淀，溶于20ml無離子水中。

（三）、測序反應：

1、引物和模板的退火：

（1）在一離心管中，混合如下幾種試劑：

引物 約1-2pmol

5×T7 DNA 聚合酶測序反應緩沖液 2ml

DNA 約1mg

加ddH2O終體積至10ml 。

（2）將試管蓋蓋上后，65℃ 加熱2分鐘，然后在大約30分鐘左右的時間內，使試管的溫度緩慢地降到室溫。降溫的過程中可使用小的加熱板或小型的保溫儀，也可使用已調至65℃的水浴，使它們的溫度在室溫下緩慢地降至室溫即可。當溫度降至30℃以下時，退火結束。可將小試管置于冰上，退火完畢的模板須在4小時內使用。

2、標記反應

（1）在一個標準的反應過程中（從引物處開始，可讀到500個堿基以上），首先需要按1:5稀釋標記混合物。如4ml 混合物則加雙蒸無離子水16ml。該稀釋液儲存在 -20℃可使用數周。如果所要測定的序列小于30個堿基，可將標記緩沖液稀釋15倍，同時，模板DNA 要高于0.5pmol。由于DNA 模板量的不足，會降低標記反應的程度，即只標記引物后的幾個核苷酸。

（2）用冰預冷的TE緩沖液按1:8稀釋T7 DNA 聚合酶。酶液稀釋后應立即使用，置于冰浴不宜超過60分鐘。不得使用標記混合物、DTT溶液或非緩沖液類溶液稀釋酶液。

（3）在已退火的引物 -模板混合物中，依次加入：

0.1mol/L DTT 1.0ml

標記混合物 2.0ml

[a-35P]dATP或[a-35S]dATP 0.5ml

已稀釋好的T7 DNA 聚合酶 2.0ml

混合充分（注意不得產生氣泡），置于室溫5-10分鐘。

如果在電泳時碰到帶壓縮問題，則dITP 混合物的效果優于dGTP混合物，dITP混合物的使用方法與dGTP混合物的使用是相似的。

[注意] 1、稀釋時應將所有的溶液預先混合完全后再加入酶液。

2、在第（3）步的過程中，如果反應中有幾次冷卻，保溫的時間過長或溫度太高的話，則會使測序反應短于100個堿基。

3、鏈終止反應：

（1）取4支eppendorf管分別標上G，A，T，C。

（2）每個管分別加入2.5ml G，A，T，C鏈末端終止混合物，立即蓋上蓋子以防液體蒸發（本反應最好在標記反應前做好）。dGTP和dITP混合物依據各自需要 選用。

（3）將eppendorf管預熱至37℃ 1分鐘。

（4）待標記反應完畢后，取3.5ml標記反應液至上述4支eppendorf管中，稍微離心一下，并將上述四管置于37℃保溫。注意在每一次反應中，均應使用新的吸液頭，以免交叉污染。

（5）繼續保溫3-5分鐘（若使用dITP時，保溫時間可延長至30分鐘，對反應產物沒有任何影響。

（6）在上述四管中各加入4ml終止緩沖液。混合均勻后，置于冰浴中。本樣品即可上樣電泳。用35S標記反應的樣品可置于-20℃保存一周，此時樣品只有極少量的降解。而32P標記的則需在當天電泳以免降解。

（四）測序凝膠板的制備及電泳 參考第一節測序凝膠板的制備及電泳部分。樣品加熱至75-80℃ 2分鐘，立即上樣，每個泳道的使用量為2-3ml

（五）測序凝膠板的干燥及放射自顯影。

電泳完畢后，經32P或35S標記的產物可用對b-射線敏感的X-光膠片放射自顯影檢測。

1、取下電泳的玻璃板，去除兩邊的壓條，用小的薄鋼片撬開玻璃板。若玻璃板用粘合硅烷處理過，凝膠會緊緊地粘合于玻璃板上，則凝膠與玻璃板一起進行下面步驟的處理。如果玻璃板沒有經過粘合硅烷的處理，則可用3MM大濾紙貼在有凝膠的玻璃板上，小心地揭下凝膠，準備下一步的處理。

2、去除尿素，將含有凝膠的玻璃板或濾紙浸于含有2升10%冰醋酸的大號顯液盆中，輕輕振蕩15分鐘，去除尿素。

3、干膠：含有凝膠的玻璃板可用電吹風吹干，而含有凝膠的濾紙則可用專用的干膠設備如真空加熱干膠儀抽干。

4、已經干燥的凝膠即可進行放射自顯影。在玻璃板含有凝膠的這一面加上X-光片后，用另一塊相似大小的玻璃板夾住，然后用夾子固定，置于暗盒中曝光。而含有凝膠的濾紙則可置于X-光曝光盒中放射自顯影。一般32P曝光過夜即可，而35S為2-3天。

5、曝光完畢后的X-光片即可沖洗，獲得序列信息。將X光片置于水中先濕潤，然后置于顯影液中顯影，直至條帶清晰顯示為止。X-光片用水淋洗片刻后置于定影液中定影15分鐘以上。取出X-光片干燥并讀出序列。

[ 注意] 1、去除尿素是非常重要的，如果有殘存的尿素，則在干膠過程中會使凝膠很粘，而無法進行放射自顯影。可以用10%冰醋酸洗二次，第一次15分鐘，第二次 10分鐘。如果膠濃度高于12%，則有可能在干膠過程中會產生皺紋，防止的方法有二種：（1）冰醋酸溶液中加入1%-2%的甘油；（2）不干燥膠，直接在冰箱中以冰凍狀態曝光，應注意的是在使用這個方法時，要在凝膠和X-光片之間加一層薄的塑料薄膜。一般來說都使用第一種方法。

2、凝膠一定要充分干燥方可進行曝光，否則X-光片會粘在膠的表面，致使以后的操作困難。

3、曝光時間應根據所使用的同位素而定，如果同位素已過半衰期則應相應延長曝光的時間。