CRISPR／Ca9應用及前沿研究

CRISPR：細菌體內一串規律成簇的間隔短回文重復 (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)DNA 序列，是大多數細菌及古細菌中一種獲得性免疫系統。現在使用的 CRISPR/Cas 9 系統是由最簡單的 type II CRISPR 改造而來，該系統由單鏈的 guide RNA 和有核酸內切酶活性的 Cas 9 蛋白構成。

原理

此系統的工作原理是 crRNA(CRISPR-derived RNA) 通過堿基配對與 tracrRNA(trans-activating RNA) 結合形成 tracrRNA/crRNA 復合物，此復合物引導核酸酶 Cas9 蛋白在與 crRNA 配對的序列靶位點剪切雙鏈 DNA。通過人工設計這兩種 RNA，可以改造形成具有引導作用的 sgRNA (single-guide RNA)，足以引導 Cas9 對 DNA 的定點切割。

作為一種 RNA 導向的 dsDNA 結合蛋白，Cas9 效應物核酸酶是已知的第一個統一因子 (unifying factor)，能夠共定位 RNA、DNA 和蛋白，從而擁有巨大的改造潛力。

將蛋白與無核酸酶的 Cas9(Cas9 nuclease-null) 融合，并表達適當的 sgRNA，可靶定任何 dsDNA 序列，而 sgRNA 的末端可連接到目標 DNA，不影響 Cas9 的結合。因此，Cas9 能在任何 dsDNA 序列處帶來任何融合蛋白及 RNA。這一套系統為生物體的研究和改造帶來巨大潛力。

有什么用？

通過 Cas9 蛋白形成 DNA 雙鏈的斷裂，然后細胞通過 NHEJ 的修復會造成 INDEL 效應 (insertion and deletion)，進而造成基因的移碼突變而達到基因敲除的目的。此外，還可以通過同源重組等方式達到對基因精確編輯的目的。

事實上，在此之前已經發展了多種基因編輯工具，如：ZFN，TALEN 等，但實際應用不方便或成本過高。CRISPR/Cas9 系統則相對較為簡單，廉價，高效，而且可以多處打靶。

此外，在內切酶活性失活的 Cas9 蛋白后加入 KRAB/VP64 等 effector 形成融合蛋白，可對下游基因進行調控。

怎么用？

如果是對于細胞的編輯可通過導入編碼 guide RNA 和 Cas 9 的質粒；若是做動物模型一般則是顯微注射 RNA。Addgene 上有多個實驗室開發出來的載體，具體可查看：Addgene: CRISPR/Cas Plasmids for Genome Editing

意義

CRISPR/Cas9 系統可謂是 2013 年生物界的焦點，這項技術相對于 ZFN,TALEN 等基因打靶技術可以說是簡便，經濟得多，一般的實驗室都可以構建自己的平臺。如果要應用于臨床治療中，其脫靶效應應該是最應該解決的問題。該技術應用于臨床治療應該還有一段距離。

以下是 CRISPR/Cas9 重大的研究或發現。

1. 兩篇 Cell 表明利用一種基于 CRISPR/Cas9 的技術有望治療脆性 X 染色體綜合征

doi:10.1016/j.cell.2018.01.012; doi:10.1016/j.cell.2016.08.056

來自美國懷特黑德生物醫學研究所的研究人員首次使用他們開發的一種移除甲基化的改進型 CRISPR / Cas9 系統恢復了受這種疾病影響的神經元中的 FMR1 基因活性，這提示著這種方法可能經證實是一種靶向由異常甲基化引起的疾病的有用范例。

這項研究是首個直接的證據表明對 FMR1 基因的特定片段進行去甲基化能夠重新激活這個基因，從而拯救受脆性 X 染色體綜合征影響的神經元（以下稱脆性 X 染色體綜合征神經元）。

2.Science：利用 CRISPR/Cas9 構建出細胞事件記錄器---CAMERA

doi:10.1126/science.aap8992; doi:10.1126/science.359.6377.728

在第一種被稱為「CAMERA 1」的細胞記錄系統中，來自美國布羅德研究所的 Weixin Tang 和 David R. Liu 兩名研究人員將兩種彼此之間略有不同的質粒注射到細菌細胞中，隨后在接觸到所需的刺激物期間，利用 CRISPR/Cas9 對這兩種質粒中的一種進行切割，從而誘導細胞產生另一種質粒來取代它。

這樣做就會在事件發生時記錄它們。這種技術允許這兩名研究人員記錄細胞如何對營養物或抗生素等刺激物作出反應。

在第二種被稱為「CAMERA 2」的細胞記錄系統中，當所需的信號在細胞中發生時，這兩名研究人員利用堿基編輯器（base editor）改變遺傳密碼中的單個堿基。利用這種技術，他們記錄當接觸病毒、營養物和抗生素等刺激物時，細胞如何作出反應。他們報道這種技術成功地用于細菌細胞和人細胞中。

3.Cell Rep：解釋為何 CRISPR/Cas9 存在脫靶效應

doi:10.1016/j.celrep.2018.01.045

Cas9 蛋白的發現簡化了基因編輯，甚至可能在不遠的將來消除很多遺傳性疾病。利用 Cas9，科學家們能夠切割細胞中的 DNA，從而校正發生突變的基因，或者將新的遺傳物質導入到這個新被切開的位點上。

最初，CRISPR/Cas9 系統似乎是非常準確的。然而，如今，顯而易見的是，Cas9 有時也切割與它靶向的序列相類似的其他 DNA 序列。在一項新的研究中，來自荷蘭代爾夫特理工大學的研究人員開發出一種數學模型來解釋為何 Cas9 會切割一些 DNA 序列，同時又讓其他的 DNA 序列保持完整。

4.Nat Microbio：重大發現！科學家發現新的 CRISPR/Cas9 系統！

doi:10.1038/s41564-017-0103-5

來自弗萊堡大學的科學家們現在發現 RNA 酶 E 也可以作為藍藻細菌中 CRISPR/Cas9 系統的 RNA 剪刀。這種酶非常常見，不僅出現在光合成藍藻細菌中，同時還出現在一些致病的細菌和植物葉綠體中。它是所有這些物種正確調節基因表達的重要因子。