3種方法檢測痰結核分枝桿菌的比較

       目前從痰中檢測結核分枝桿菌仍是診斷肺結核的重要方法，痰結核分枝桿菌檢查對發現傳染源、確定治療方案、考核療效、評價防治效果等具有重要意義。本文對558 例肺結核患者及疑似患者痰標本同時進行涂片抗酸染色法、快速結核菌培養法和熒光定量PCR技術檢測結核分枝桿菌，并對3種方法的陽性率進行比較，為臨床提供更實用、科學的檢測方法。

       1、資料與方法

       1.1  標本

       558 例痰標本來自本院門診和病房的肺結核患者及疑似患者，囑患者清晨嗽口，然后從深部咳痰2～3口于一次性無菌塑料瓶內送檢。

       1.2  試劑與儀器

       萋尼氏染色試劑(按文獻［1］的方法自行配制)、痰消化液、pH6.8的磷酸鹽緩沖液、結核分枝桿菌PCR熒光定量檢測試劑盒及DA7600熒光定量PCR儀(深圳達安生物技術有限公司提供)、顯微鏡(日本奧林巴斯)、低溫高速離心機(美國Thermo Fisher Scientific)、生物安全柜(美國NUAIRE)、BacT/ALERT 3D全自動分枝桿菌培養檢測系統(購于生物梅里埃有限公司)。
　
       1.3  方法

       1.3.1  涂片抗酸染色法　

       所有操作嚴格按照《抗酸桿菌涂片檢查操作程序》(中國疾病預防控制中心結核病防治臨床中心與國家結核病參比實驗室制訂)進行。

       1.3.2  快速結核菌培養法

       取痰標本，采用半胱氨酸氫氧化鈉法前處理(左旋半胱氨酸臨用時配制)。視標本性狀，加1～2倍體積的處理液于無菌痰杯中，使痰液充分液化，整個處理時間不超過20 min，移入50 mL離心管振蕩均勻并加入pH6.8的磷酸鹽緩沖液至50 mL處，4 000 rpm離心20 min，棄上清液，加0.2％牛血清1 mL，混勻。取0.5 mL加入到BacT/ALERT 3D培養管(預先以75％乙醇消毒瓶口，待自然風干后，加入0.5 mL抗生素補充劑)，以上操作均在生物安全柜內進行。BacT/ALERT 3D培養管置儀器培養，去除陽性標本，陰性標本42 d報告結果［2］。

       1.3.3  熒光定量PCR技術

       取痰標本，加入4倍體積的4％氫氧化鈉溶液，搖勻，室溫液化30 min，取1～1.5 mL，15 000 rpm離心5 min，棄上清液，沉淀用無菌生理鹽水1 mL打勻，15 000 rpm離心5 min，重復洗滌1次，棄上清液，沉淀加入50 μL DNA提取液，充分混勻后沸水浴10 min，10 000 rpm離心5 min，取5 μL樣本加入到PCR管內，設置反應體系，擴增完計算機自動分析，建立標準曲線，計算出標本中擴增片段的拷貝數。

       2、結果 

       (見表1)表1  3種檢測結核分枝桿菌方法的陽性率結果（略）

       3、討 論

       結核病是一種感染性疾病，病因很明確，實驗室診斷是確診的主要依據。對肺結核診斷最有價值的是細菌學檢查，由于菌陰肺結核在肺結核中占相當大的比例，抗酸染色陽性率低，靈敏度和特異性也很差，并受送檢標本質量影響較大［3］，結核菌快速培養所需時間較長，陽性率也較低，給肺結核的早期診斷帶來困難。本文結果表明，3種方法對558 例痰標本中結核菌的檢出率差異有顯著性(P＜0.05)，熒光定量PCR技術檢測的陽性率為47.8％，明顯高于涂片抗酸染色法和快速結核菌自動培養，這與國內文獻相關報道基本相同［4］。另外整個熒光定量PCR檢測過程包括擴增樣本的制備和檢測報告的發出，僅需要5～6 h，大大縮短了結核分枝桿菌的檢出時間，可以作為肺結核患者早期診斷和鑒別診斷的重要依據，還可以通過相對定量檢測體現病原體含量與復制水平、感染程度之間的關系，為評價和考核治療效果及監測疾病發展和轉歸提供有效信息，是一種簡便、快速、特異的結核分枝桿菌檢測方法。3種檢測方法的敏感性比較，熒光定量PCR技術也明顯高于快速結核菌培養法、涂片抗酸染色法。3種方法陽性報告時間比較，涂片抗酸染色法和熒光定量PCR技術遠比快速結核菌培養法要短，而涂片抗酸染色法的陽性檢出率很低，對臨床早期診斷和治療幫助有限。

       目前，PCR技術已廣泛用于感染性疾病、腫瘤、遺傳病等疾病診斷及生物工程等各個方面。傳統PCR技術在臨床應用仍有一定局限性，其原因主要表現在對核酸樣本的分離純化過程中引起的假陰性和由于擴增產物污染和實驗操作所致標本污染引起的假陽性兩個方面。熒光定量PCR技術克服了傳統PCR技術易污染、假陽性率高的缺點，具有操作簡單、結果可靠、重復性和特異性好、靈敏度高、可定量等優點。

       當然，僅憑1次熒光定量PCR結果就作出診斷是片面的，還應結合臨床表現、影像學檢查及其他實驗室相關檢驗等綜合判斷，可疑患者還可以復查或用支氣管肺泡灌洗液檢測結核分枝桿菌。科學研究已經證明，人類疾病大都直接或間接與基因有關，臨床實驗醫學正在進入基因診斷時代，應用熒光定量PCR技術檢測痰中的結核分枝桿菌可作為可疑肺結核患者的首選檢查之一，尤其是對因菌量少或細菌發生L型變異而不易分離培養成功的標本更有實用價值，并應成為臨床結核分枝桿菌實驗診斷的常規技術［5］。

       【參考文獻】

       ［1］中華人民共和國衛生部醫政司.全國臨床檢驗操作規程［M］.3版.南京：東南大學出版社，2006：791798.

       ［2］楊順利，范夢柏，張吉平.結核菌培養方法對照與效果分析［J］.中國藥物與臨床，2007，7：10.

       ［3］葉林德.肺結核患者痰液性狀對檢測結果的影響［J］.浙江預防醫學，2002，14(7)：80.

       ［4］張翊，盧建平，葉淼.四種結核分枝桿菌檢測方法的臨床應用評價［J］.中國防癆雜志，2006，28(1)：1417.

       ［5］陳紅兵，周志紅，賀潤年，等.熒光定量PCR技術在結核桿菌檢測中的應用［J］.實用醫學雜志，2008，24(21)：3 7653 767.