real time RT-qPCR 是檢測樣本中特定基因表達量的有效方法，包含逆轉錄步驟和定量PCR步驟。好的開始是成功的一半，獲得高質量的、能正確反應樣品中轉錄情況的RNA，對于其后的定量結果，自然是非常重要的。
Mikael Kubista，教授, R&D TATAA Biocenter主任：
RNA質量包含兩個方面：樣品的純度和RNA的完整性。樣品純度可以在樣品稀釋時得到改善。我們通常通過Nanodrop測量吸光值來檢測純度。
260/280吸光值的比率應該在2至2.1的范圍內，并且是“漂亮”的吸光光譜曲線。230nm吸收峰應該低。我們通過利用Experion
(Bio-Rad)記錄電泳圖（electropherogram）檢測RNA的質量。當然，最理想的結果是得到很清晰的18S和28S峰值。但RNA的完整性是無法改善的，保存樣品、固定樣品和來源于富含降解酶的器官的樣品RNA完整性通常不好。檢測RNA質量的兩個原因，一是想要知道某一個實驗得到的
RNA質量，從而選擇適當的RT-qPCR方法，二是識別出研究中的樣品的質量是否比正常情況差，避免導致偏差或者不正確的結果。
Jo Vandesompele，根特大學醫院（Ghent University Hospital）醫學遺傳學中心
高質量的RNA應該是完整的、不含抑制劑的。我們習慣利用毛細管凝膠電泳系統來評價28S和
18S條帶的比率，過程很快速并且只需要很少量的RNA。值得注意的是，這個比率是組織或者細胞特異的，所以理想的是你應該將樣品與一個同樣細胞來源的完整對照比較。在芯片分析（微陣列研究）中通常都要求進行RNA質量分析，現在許多定量PCR領域的人們開始考慮RNA質量這個因素。我們最近在發表的文章說到評價用于PCR分析的RNA的質量尤為重要，這是由于并非每個基因降解水平都相同，嚴重時甚至可以使你的實驗結果出錯(Perrez-Novo
et al., 2005)。我們主要的結論是：參考基因(reference
gene)的穩定性在完整樣品（intact）和在降解樣品中是有差別的，因此你不應該將完整的樣品和降解的樣品相比，尤其是你在研究精確的表達差異時。
檢測核糖體吸收峰值是目前評價RNA完整性的金標準，但其實rRNA僅是mRNA成分完整性的一個代言標記。我們開發了一種基于PCR的分析實驗，可以比較一個特定基因的5'和
3'
端amplicons的比率。通過比較未知樣品和完整的對照樣品的比率，我們能夠利用PCR分析實驗衡量mRNA的完整性，與電泳評估/rRNA評估相比更具有直接相關性。
為了評價制備RNA的純度（例如沒有抑制劑），我們實行qPCR SPUD分析，既簡單易用又免費(Nolan et al., Anal Biochem, in press).
Tim Hunter，英國倫敦大學學院（UCL）：
你需要建立靈活的操作流程來分離高質量的RNA。樣品類型決定著哪一種分離方法是最好的。通常，初步的質量監控檢查是在NanoDrop
分光光度計進行核酸定量的時候，260吸收峰外的讀數值可指示污染情況。260/280的比率應該在1.8
至2.1的范圍內。同樣非常關鍵的，是要保證實驗所用的RNA質量（全長、完整性）不打折扣，因此，我們通常利用Agilent 2100
Bioanalyzer檢查RNA的完整性，并根據rRNA峰值的完整性判斷RNA樣本的情況，選擇下一步實驗適合的方法。假如有證據顯示重要樣品有降解，我們會同時檢測一個在該樣品中已知穩定的管家基因，來觀察是否出現由于轉錄產物不完整而導致管家基因在這個樣本中的表達改變。當探針并非處于外顯子—
外顯子邊界時，我們會同時選擇中/高表達的管家基因作(-)RT對照，以檢查基因組DNA的污染情況。樣品可在37oC下孵育2-4小時，并重新在
Bioanalyze上分析降解情況，以檢查核酸酶的活性。
Cristina Hartshorn,美國Brandeis大學生物學系：
我認為高質量RNA是指正確代表細胞內容物的轉錄池（transcript
pool）的RNA。我們實驗室非常注重RNA的回收率，尤其是來源于像單個細胞等的微量樣品中RNA的純化，需要盡量減少可能導致核酸降解的操作步驟。因此，我們開發了一種能在同一支試管里連續進行收集細胞、裂解細胞、去除蛋白雜質、逆轉錄和實時定量PCR等操作的整體流程。這種整個實驗在單個試管內進行的方法稱為PurAmp
(Hartshorn et al., 2005a; Hartshornet al.,
2005b)，該方法基于稀釋法，并且不需要將RNA結合到任何純化基質上去，因此保證了實質上純化得到完整的RNA庫。此外，我們覺得轉錄產物的完全去蛋白化對于RT引物與模板的正確結合、以及最終模版定量的精確性和可重復性來說是十分必要的，這就像對基因組DNA模板制備來說是必需的一樣。
PurAmp方法有時要求一個DNase消化的步驟，但是我比較喜歡避免這一步。我嘗試過多種DNase操作方法，但結果總是發現回收的RNA比預期的少。這可能是因為最后一步高溫失活酶的步驟導致了RNA的水解。一些商品化的手冊表明經過“+
/ -
DNase”處理后的實時PCR循環，特定樣品的信號會出現幾個循環的Ct漂移（shift）。其實，考慮到每個細胞中特定的基因的拷貝數比該基因表達時的轉錄產物的拷貝數少得多，這種漂移幾乎是難以察覺的，因此，不應該在DNase消化后稀釋模板數量。我喜歡一起擴增DNA和RNA模板，最后消減去基因組DNA的拷貝數（詳細請見Question
5）。
Jim Huggett，佛蒙特州大學（University of Vermont）癌癥中心：
我們在英國的實驗室通常利用Agilent
Bioanalyzer評估核糖體RNA條帶來評估純化RNA的質量。然而，由于我們在撒哈拉以南的非洲國家開展許多研究工作，這里儀器缺乏，所以我們要用瓊脂糖凝膠電泳來評價rRNA，從而告訴我們核糖體RNA條帶是否OK，以及我們的RNA提取工作是否有效；然而，越來越多證據表明，這些rRNA條帶的降解不一定意味著mRNA降解。用什么方法進行質量評估是個人的喜好，現有的評估方法還是必需的。
Xiuling Zhang,紐約州衛生署（New York State Department of Health）Wadsworth Center:
對于從人類組織中分離的RNA樣品來說，我的高質量RNA標準是：
1． rRNA 比率 [28s/18s] ≥ 1. 1, RNA完整系數 (RIN)≥ 7 (利用Bioanalyzer 2100進行分析)
2. 28s和 18s 條帶明顯(變性瓊脂糖凝膠電泳)
3. 比率 [260nm/280nm] ≥ 2.0 (分光光度計測量).