高效液相色譜與化學計量學方法聯用

摘要:用鄰苯二甲醛和N-乙酰-L 半胱氨酸作為柱前手性衍生化試劑,使用常規反相高效液相色譜法拆分DL-氨基酸對映體,對于不能達到基線分離的色譜峰,應用化學計量學方法計算分析,從而達到同時定量測
定多種氨基酸對映體的目的.

近年來氨基酸分析在生物化學、藥學和臨床研究上都有著廣泛而重要的應用. 氨基酸的分離,尤其是氨基酸對映體的分離一直是國內外的研究熱點.在手性分離這一領域,高效液相色譜法（HPLC）一直是最廣泛使用的方法. 目前高效液相色譜分離手性化合物主要有兩種方法:一種是直接分離法,也就是利用手性固定相直接分離手性化合物對映體. 王亞麗[1 ] 等曾用纖維素-三（ 3 , 5-二甲基苯基氨基甲酸酯）（CDMPC） 手性柱在正相模式下拆分了3 種外消旋氨基酸的衍生物. 另一種是間接分離法,目前主要是柱前衍生化法———將手性化合物柱前衍生化,將對映體轉化為非對映體,進而使用常規柱完成分離分析. 呂海濤[2 ] 曾討論過柱前衍生法拆分DL-氨基酸時流動相的影響.

本文主要討論使用柱前衍生法分離多種氨基酸的對映體,并將化學計量學方法引入絲氨酸對映體重疊峰的分析,可以一次性地定量分析多種氨基酸對映體.所用衍生劑為鄰苯二甲醛（OPA） 和N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC） [2 ,3 ] . NAC是一種手性硫醇,其它手性硫醇如N-乙酰-D-青霉胺（NAP） 、N-異丁酰-L-半胱氨酸（ IBLC） 、N-異丁酰-D-半胱氨酸（IBDC） [4 ] 也可與OPA 一起做為衍生劑.

1 　實驗部分

試劑與儀器

DL-絲氨酸（上海麗珠東風生物技術有限公司） ;L-絲氨酸、β丙氨酸、DL-丙氨酸、L-丙氨酸、DL-苯丙氨酸、L-苯丙氨酸、DL-纈氨酸、L-纈氨酸、硼酸、氯化鉀、氫氧化鈉、乙酸鈉（中國醫藥集團上海化學試劑公司）;鄰苯二甲醛（以下簡稱OPA ,中國醫藥集團上海化學試劑公司） ;N-乙酰-L-半胱氨酸（以下簡稱NAC ,Lancaster 公司） ;甲醇（HPLC 級,Merck 公司） ;高純水. 除甲醇和水外其他試劑均為分析純.美國Aglient HP1100 高效液相色譜儀（DAD 檢測器） ,ChemStation 化學工作站. 美國Aglient8453 UV
- Vis 光譜儀.

1. 2 　樣品預處理[5 ]

各氨基酸樣品配制成濃度約為0. 01 M 的水溶液.硼酸緩沖液的配制:硼酸（0. 01 M） 、氫氧化鈉（0. 01 M） 和水按體積比50∶45∶5 配制得到pH 為9. 3的硼酸緩沖液.衍生劑的配制:將53. 3 mg OPA溶于50 mL 甲醇得到OPA 甲醇溶液. NAC 溶于硼酸緩沖液中（0. 00286 M） . 取12 mL OPA 甲醇溶液、10mL NAC 硼酸溶液,添加3 mL 硼酸緩沖液至25 mL ,得到OPAPNAC 衍生劑.

1. 3 　衍生反應

將0. 1 mL 氨基酸與5 mL OPAPNAC 衍生劑徹底混合5 min 后過濾進樣分析.

1. 4 　色譜條件

ZORBAX Eclipse XDB - C8 色譜柱（4. 6 mm 3 150mm , 5μm） . 不同比例的甲醇和0.05 M醋酸鈉水溶液為流動相,流速1 mL·min - 1 ,進樣量20μL. 所有的色譜分離均在室溫下進行, 在線檢測波長為334nm ,DAD 檢測波長范圍為190～400 nm. 非負矩陣因子分解（NMF） 計算截取的數據波長范圍為320 nm～390nm.

1. 5 　數據處理方法

本實驗采用非負矩陣因子分解（NMF） [6 ] 計算兩個混合組分的純譜. 非負矩陣因子分解是在“非負”限制約束條件下的一種矩陣分解新方法,它的基本思路是將非負矩陣V 分解成兩個非負因子矩陣W和H.NMF 算法中采用了乘法更新公式（見公式（1）和（2） ） ,所以不必采用其它限制條件即能保證分解結果“非負”.

2 　結果與討論

2. 1 　氨基酸對映體的分離

氨基酸與衍生劑的反應生成異吲哚類產物[7 ] ,反應方程式見圖1. 由紫外測量得到的圖譜可看出,此類衍生產物在230 nm 和334 nm 處各有一個最大吸收（見圖2） . 但由于230 nm 處較易受干擾,故在色譜實驗中除了記錄全波長數據外,選擇334 nm 作為檢測波長. 下文中所提到的氨基酸色譜峰均為其經過上述衍生化后所得到的衍生物的色譜峰.

圖1 　DL-丙氨酸的衍生反應方程式

圖2 　2β丙氨酸衍生物在190 nm～400 nm 處紫外吸收

實驗結果表明,在甲醇∶醋酸鈉溶液為30∶70 的淋洗條件下,除DL-絲氨酸的兩種對映體有部分重疊外,DL-丙氨酸、DL-纈氨酸和DL-苯丙氨酸的對映體能得到基線分離,但是DL-纈氨酸的兩種對映體出峰時間為17 min 和25 min ,DL-苯丙氨酸的兩種對映體出峰時間為38 min 和43 min.此分離條件下,不僅浪費流動相,而且峰形不理想. 如果將流動相的比例調節至45∶55 ,雖然可使DL-纈氨酸和DL-苯丙氨酸的對映體在10 min 內洗脫出峰,但將使DL-絲氨酸及DL-丙氨酸完全或部分重疊.考慮到DL-纈氨酸和DL-苯丙氨酸保留過強的情況,操作中采用了簡單的梯度淋洗,在前三種氨基酸全部出峰后,改變流動相配比使DL-纈氨酸和DL-苯丙氨酸快速出峰. 淋洗方案如下:在0～6 min 內保持甲醇∶醋酸鈉溶液為30∶70 不變,在6～7 min 由此比例線性變化至45∶55 ,在7 min 以后保持45∶55不變. 各對對映體的定性采用左旋光學純標樣通過內標法確定.β丙氨酸沒有手性,沒有對映異構體,只有一個色譜峰. 圖3 為DL-絲氨酸、DL-丙氨酸、β丙氨酸、DL-纈氨酸和DL-苯丙氨酸混合物衍生后的色譜圖.

圖3 　四種外消旋氨基酸和β丙氨酸的色譜

2. 2 　波譜解析法的使用

由圖3 可看出,盡管采用梯度洗脫,此譜中仍有一對重疊峰—絲氨酸的兩個對映體. 在這種情況下,

如果要定量分析此體系,知道兩組分的實際峰面積是必需的. 我們使用非負矩陣因子分析解析出兩組分的純譜（見圖4） ,但此結果與實際純譜還存在一個系數關系,即AXD-Ser + BXL-Ser = YDL-Ser .為得到兩組分實際的純譜,我們用最小二乘回歸（ least squaresregress , LSR） 來計算系數A 和B,得到的結果如下（見圖5） : A = 72. 59 ; B = 75. 98. 此系數乘以各自組分的純譜即為兩組分的實際峰面積.

2. 3 　各對映體的定量分析

2. 3. 1 　標準曲線的建立　采用單一對映體標樣在不同濃度值下的色譜峰面積或峰高建立標準曲線.實驗中選用L-丙氨酸和L-苯丙氨酸作為兩種標樣,L-丙氨酸對應甲醇∶醋酸鈉= 30∶70 的色譜條件,L-苯丙氨酸對應甲醇∶醋酸鈉= 45∶55 的色譜條件. 以濃度對峰面積或峰高進行線性擬和,得到標準曲線方程（見圖6 ,7） . 通過此方程可以測定混合樣品中兩個標樣組分的濃度.

2. 3. 2 　其它組分相對濃度預報　在同樣的色譜條件下,體系中各組分的含量比與其色譜峰面積比成線性關系. 各組分的峰面積和所占面積面分比結果見表1 ,其中D-絲氨酸和L-絲氨酸的單峰面積是根據上述化學計量學方法計算而得.

3 　結　論

本文運用柱前衍生化法使用常規反相高效液相色譜實現了4 種氨基酸對映體的拆分,達到了較好的分離效果,并實現了多組分定量分析. 文中所用的淋洗方案也比較簡單. 使用計算方法解析重疊峰相對降低了對色譜峰分離度的要求,這對于分析更加復雜的樣品體系是很有幫助的