實驗概要
制備高效的感受態細胞，以備后續的連接轉化實驗。
主要試劑
SOB 培養基
SOC 培養基
LB 培養基
DMSO（國產分析純）
TB緩沖液
液氮
實驗步驟
1. 方法一
1) 劃線得到單菌落，37℃培養箱培養約17小時；
2) 挑取2-4個形態飽滿的單菌落接種于裝有100ml SOB 培養基的三角瓶，37℃劇烈振蕩（300 rpms）培養3-4小時；
3) 將培養溫度調至18℃劇烈振蕩（3280 rpms）培養，其余與普通感受態差不多；
4) 每管加入4ml TB緩沖液，輕輕振蕩，使菌體重新懸浮；
5) 加入280ml DMSO（可用國產分析純），混勻后分裝入1.5ml EP管，冰上靜置15分鐘；
6) 用紗布將所有裝有感受態的EP管包好，用棉線系好后放入液氮中速凍，在液氮中靜置12小時以上。取出感受態放入-70℃超低溫冰箱備用。
注：效率非常高，一般可到108，好時可到109，特別適宜于大片段與文庫構建及珍貴材料的連接轉化。
2. 方法二
1) 液氮或低溫冰箱中取出的大腸桿菌E.coli DH5α，JM109，HB101等，在LB平板上劃線，37℃過夜至長出單菌落；
2) 挑直徑1-3毫米的單菌落可多個，接種到250毫升/3升錐形瓶或80毫升/1升錐形瓶的SOB培養基，培養基量不可再多，會影響效率；
3) 在18℃ 150-250RPM 培養19-50小時沒有冷卻搖床的可在室溫，但不可高于37度；
4) OD600約0.4-0.8時停止培養，放在冰水中冷卻10分鐘；
5) 4℃，300RPM離心15分鐘，回收菌體；
6) 去掉上清后，用1/3體積的冰冷TB溶液懸浮，在冷10分鐘；
7) 再次離心回收菌體；
8) 用1/12.5體積的TB懸浮，添加最終濃度為7%的DMSO，再冷卻10分鐘；
9) 0.1-1毫升分裝，直接在液氮中凍上；
10) 在液氮或-80℃保存。
3. 方法三
1) 將置于液氮保存的大腸桿菌劃線在LB平板上，37℃培養活化；
2) 挑取經活化的大腸桿菌單菌落于SOC液體培養基，18℃，200-250rpm培養；
3) 當OD600=0.5-0.8時，用預冷的40mL離心管于4℃，8000rpm離心10min，收集菌體；
4) 用預冷的TB Buffer重懸菌體，4℃，8000rpm離心10min，收集菌體；
5) 重復第4步操作；
6) 用8mL預冷的TB Buffer重懸菌體，緩慢加入DMSO至終濃度7% ；
7) 冰浴10min后，分裝保存于液氮中。
注：本法效率極高，建議采納。
注意事項
1. 所用器具的潔凈程度。這一點非常重要，是所有與感受態有關的方法與文章上必講的，毋庸置疑。
2. 培養基的裝量：培養基的裝量是很重要的，這關系到菌體生長過程中的能量代謝問題，是有氧還是無氧生長。厭氧生長出來的菌體是做不出效率高的感受態的。建議裝量不要高于此值為：培養基體積/三角瓶容量=100ml/500ml，50ml/250ml。
3. 培養基的pH值。這是講的pH值并非單指配置或滅菌后的pH值，而且還包括整個搖瓶結束后的pH值。一般來說，接種前的pH值在6.8-7.2，等菌搖好后，可以測一下pH值，不要低于6.0，最好在6.5以上。這表示菌體的代謝為有氧代謝，生長狀態良好，按要求做，肯定效率不低。
4. 培養后的OD值。其實這并一個非常重要的參數，只是當OD值大到一定的程度后，菌體要保持對數生長已經不太可能，因此很多指導方法上強調OD不得大于0.6，0.8等等。同時，OD值大時菌體總量大，因而感受態絕對數量要大一點，因而需要在OD值的兩方面影響中找一個平衡點。
5. 培養基中的各種離子。經驗證明，當培養基中存在一定量的Mg2 離子時，該方法制得的感受態要相對較高。在制備普通感受時，使用20mM MgCl2做為培養基的添加物，在感受態收獲之前20-30分鐘加入，會收到很好的效果。
6. 培養溫度。文獻及經驗告訴我們，較低的溫度培養有利于感受態的形成，這樣可以獲得較高的感受態，但太低又不實用，因而產生了Inoue的高效感受態制備方法，它實際是利用了所有有利于感受態的文獻而得出的一個非常理想方法。
7. 此外文獻報道，在保存感受態時，DMSO要比甘油的效果要好，它會使感受態的效率增加。
8. 液氮速凍也會使感受態的效率提高，因此推薦用液氮速凍感受態，然后保存于超低溫冰箱內。至于在液氮中保存12小時以后再轉入超低溫冰箱，這點未做實驗，只是一種感覺，第一次這樣做了，沒問題，以后就照此辦理而已。