高彩霞團隊開發出不依賴CRISPR的全新堿基編輯工具

　　基因組編輯可以對生物體遺傳信息進行精準、高效的修飾，已成為生命科學領域的一項顛覆性技術。通過融合nCas9（切口酶形式的Cas9）與脫氨酶，美國哈佛大學David Liu團隊先后開發出胞嘧啶堿基編輯系統（Cytosine base editor，CBE）和腺嘌呤堿基編輯系統（Adenine base editor，ABE），將以CRISPR為代表的基因組編輯技術引入了“精準編輯”的全新時代。

　　近日，中國科學院遺傳與發育生物學研究所高彩霞團隊開發了突破CRISPR限制的模塊化結構的堿基編輯新系統——CyDENT。與此前的堿基編輯工具不同，這一系統在細胞核、線粒體和葉綠體中均實現了高效胞嘧啶堿基編輯，尤其是在線粒體編輯中展現出優良的鏈特異性和低序列偏好性，提供了具有廣泛基因組靶向能力且高精準的全新堿基編輯工具。

　　CyDENT系統包含TALE蛋白、FokI切口酶、單鏈特異性胞嘧啶脫氨酶、DNA外切酶及UGI等組分，并基于一套全新的工作模型：首先由TALE蛋白引導FokI切口酶至細胞核或者細胞器的DNA靶點處產生單鏈切口，之后由DNA外切酶從切口處對包含切口的DNA鏈進行部分外切消化，此時互補鏈將以單鏈DNA的形式呈現，成為單鏈特異性胞嘧啶脫氨酶的作用底物，并在UGI的幫助下最終完成胞嘧啶堿基編輯。由于能夠發生脫氨的DNA鏈取決于切口產生的位置，該工作模型能夠實現具有單鏈偏好性的堿基編輯，提高了編輯精準度。

　　研究分別選取水稻原生質體細胞核、葉綠體以及HEK293T細胞系線粒體中的靶點進行測試。結果顯示：CyDENT均可實現高效的胞嘧啶堿基編輯，其中在動物細胞線粒體中的編輯效率接近40%；CyDENT系統可進行具有單鏈偏好性的線粒體堿基編輯，精準性相較于基于雙鏈脫氨原理的線粒體堿基編輯器得到了提升。此外，得益于CyDENT系統的模塊化特性，研究還將該團隊近期利用AI輔助挖掘得到的全新脫氨酶（DOI: 10.1016/j.cell.2023.05.041）與其結合，對處于不同序列背景（TC或GC）下的胞嘧啶進行有效編輯，提升了堿基編輯的精準性和靈活性。通過將胞嘧啶脫氨酶更換為腺嘌呤脫氨酶，CyDENT還具有進行腺嘌呤堿基編輯的潛力。通過全核基因組和全線粒體基因組脫靶分析表明了CyDENT具有良好的編輯特異性。

　　總的來說，具有完全自主知識產權的不依賴CRISPR的全新堿基編輯工具CyDENT，首次集成了對細胞核和細胞器進行精準堿基編輯的能力。結合該團隊前期挖掘的全新脫氨酶，本研究進一步實現了CyDENT系統從核心組分到底層工作模型的全自主創新。CyDENT系統的開發，再次升級了細胞核及細胞器的精準編輯策略，對疾病治療和農作物精準分子育種具有重要的潛在應用價值。

　　8月28日，相關研究成果以Strand-preferred base editing of organellar and nuclear genomes using CyDENT為題，在線發表在《自然-生物技術》（Nature Biotechnology，DOI : 10.1038/s41587-023-01910-9）上。研究工作得到農業農村部、中國科學院戰略性先導科技專項、國家重點研發計劃和國家自然科學基金等的支持。

CyDENT堿基編輯系統及其應用。a、CyDENT堿基編輯工作模型及在細胞核和細胞器編輯中的應用；b、CyDENT在植物細胞核中的單鏈特異性堿基編輯；c、CyDENT在動物細胞線粒體中的單鏈特異性堿基編輯。