2024年10月5日，深圳灣實驗室、北京大學、清華大學等單位的科研人員合作在Nature Communications期刊發表了題為Biofunctionalized dissolvable hydrogel microbeads enable efficient characterization of native protein complexes的研究論文，主要報道了一個新型非變性蛋白質復合物的高效純化及表征方案SNAP-MS (Stationary-phase-dissolvable Native Affinity Purification and Mass Spectrometric characterization）。
研究人員利用水凝膠材料開發了新型可溶性親和微珠，捕獲目標蛋白或復合物后，采用溶解的方式將目標蛋白回收至溶液中，該溶液可與質譜兼容，直接用于非變性質譜表征（圖1）。文中將這種新型純化方法與之前傳統的親和純化策略進行了多方面的對比，也進行了自身材料的優化，對這部分內容感興趣的小伙伴們可以在原文中獲得更多的信息。
圖1 SNAP-MS 流程
而作為質譜技術的愛好者們，相信大家也都關注到了，文章中主要的蛋白表征手段是非變性質譜分析，數據采集使用了 Orbitrap Q Exactive UHMR 質譜儀。提到這臺儀器，腦子里冒出的關鍵詞基本上都是和大分子量有關系了，m/z高，特殊優化的離子傳輸組件，源內捕獲等等等等，可能大家也好奇它的數據質量到底怎樣，那么我們就以文中的幾個圖給大家做個展示。
1、獲取蛋白復合物的化學計量信息
圖2 純化的 EGFP 或 mEGFP 與 Ab結合復合物的非變性完整分子量及二級質譜譜圖
2、Top-down 分析
為了比較經過 SNAP 方法純化獲取的蛋白與原始形態的蛋白之間的區別，除了分子量層面的對比以外，作者還使用top-down分析的方法對比了兩者的碎片信息。捕獲得到的生物素-親和素復合物經過源內碎裂先后釋放出誘餌生物素和親和素蛋白單體，后者再經過 pseudo-MS3進行特定蛋白型（proteoform）的片段分析，從而實現復合物-單體-肽段的全鏈條top-down分析。圖3 展示了SNAP方法純化的親和素單體與原始親和素單體的碎片離子相關性。
圖3 比較純化回收和原始形態的親和素復合物解離（左）、單體蛋白型分布（中）和pseudo-MS3譜圖（右）
3、解析異質性高的糖蛋白
文中采用SNAP beads方法純化了人血漿中的結合珠蛋白haptoglobin（Hp），誘餌蛋白使用了血紅蛋白hemoglobin（Hb），最終獲得了Hp-Hb的復合物（圖4A）。Hp肽鏈長度多樣，多個糖基化修飾，不同聚體形態和結合形態，是一個高異質性的糖蛋白。通過非變性質譜的分析可知，4個不同血清樣品獲取的Hp的聚合形態并不相同（圖4B）。在血清中加入游離 Hb（模擬溶血條件），經非變性質譜的分析可知 Hb在 Hp-Hb復合物中的占比（圖4C）。此外，由于誘餌Hb蛋白上有一個額外的linker基團，所以相比游離 Hb 蛋白，會產生一個 126 Da的質量偏差。采用進一步的二級碎裂將Hb從Hp-Hb復合物中釋放出來，比較兩者的譜圖可對它們進行區分（圖4D）。
圖4 使用SNAP-MS 純化并表征人類血漿中的Hp蛋白
從圖中，我們可以發現，由于高異質性，Hp的質譜圖即使是在非變性條件下，仍然呈現很寬的質量數分布，對數據解析引入了很大的挑戰。
此時，依然結合在目標蛋白上的誘餌蛋白，可用于減少電荷價態，并進行質量糾正。通過二級質譜碎裂，將Hb誘餌蛋白從復合物中釋放出去，可顯著降低剩下的目標蛋白的價態、提升價態分辨（圖4E），并利用碎裂反應的質量守恒作為約束條件校正傳統解卷積算法產生的分子量偏差，有利于譜圖的數據解析。
作為一種通用策略，SNAP-MS既可以單獨使用，也可以與其他方法(如cryo-EM)結合使用，以更詳細地表征各種天然蛋白復合物的結構。另外，通過上面幾個文章中的實例，我們可以知道非變性質譜表征，從來就不止是分子量的故事，我們也期待看到更多的數據更多的應用。
專家訪談
王冠博
北京大學生物醫學前沿創新中心，研究員
Q1 ：請您談談本研究的難點在哪里？
作為一個主要面向蛋白復合物的分析策略，非變性質譜最終需要解決生物醫學分析中的問題。盡管質譜對純度的要求相對較低，非變性質譜的應用多年來仍然主要局限在高度純化的蛋白以及體外重構的復合物范疇，尚不能作為生物樣本乃至臨床樣本的常規分析手段提供更直接的信息。思維慣性是技術開發和應用中的最大困難，如何與生物醫學需求有效對接是我們面臨的切實要務。清華大學王建斌教授不僅了解生物學家的需求，對化學分析原理也有很精深的見解，這樣的合作促使我們用新思維去嘗試提升理論性能到實際價值的轉化率。課題也得到清華大學王宏偉教授的大力指導，強化了純化、質譜和冷凍電鏡的對接。合成體系優化以及流程細節驗證都導致課題執行周期遠超預期，兩位一作在文章發表前已經博士畢業，重重壓力也是實際需要克服的困難。
Q2 ：UHMR 組合型四極桿 Orbitrap質譜儀在該研究中發揮了怎樣的作用？
我們的目標體系呈現分子量分布寬和異質性高兩大特點：目標復合物分子量動輒達到數百萬道爾頓（MDa），要求儀器有充分的質量檢測范圍；大量目標蛋白存在糖基化等復雜修飾，高異質性導致信號難以解析，我們所開發的一系列解決方案也要求儀器具有充分的分辨能力。我在荷蘭Heck課題組工作期間參與了UHMR原型機驗證，對它的性能有比較早的了解；我們的質譜團隊在北大黃巖誼教授支持下購置了國內第一臺UHMR儀器，它同時具備的超高質量范圍和超高分辨兩大性能提供了勝任研究目標的硬件保障。
Q3 ：本研究開發的SNAP-MS技術流程對實現天然蛋白復合物的高效分析及應用有哪些深遠意義？
首先談不上深遠，我們這個課題的初心是能為蛋白結構質譜應用于生物樣本乃至臨床樣本發揮一小步實實在在的推進作用。文章發表只能說明數據結果獲得了評閱同行和編輯的認可，技術就緒程度還需要業界的廣泛檢驗。先驅們打出了非變性質譜、top-down組學等結構質譜策略的旗幟，我們希望能作為火把傳遞的一員為這些技術的普適工具化出一份力。SNAP-MS只是一個開端，我們會繼續以實際應用場景作為指引，結合儀器的優勢性能，在天然化、原位化的方向上嘗試一系列的技術拓展，努力讓更多結構質譜方法呼之即來，來則可用。
專家簡介
王冠博，北京大學生物醫學前沿創新中心研究員。北京大學學士，美國馬薩諸塞大學博士；曾于荷蘭蛋白質組學中心從事博士后研究；曾任南京師范大學教授、博士生導師。主要從事免疫反應相關蛋白質的高級結構及相互作用研究，以生物質譜為核心工具，結合新型分析設備研發，發展一系列新型技術，在多個結構層次實現對高復雜度蛋白的動態結構分析，應用于免疫反應分子機制研究、生物藥物研發等領域。成果發表于Nat. Commun.、PNAS、Mol. Cell等期刊；獲國內外多項授權專利。著有《Mass Spectrometry in Biopharmaceutical Analysis》等專著、譯著、合著多部。任中國生物化學與分子生物學會蛋白質組學專業分會委員、國際學術組織Consortium for Top-Down Proteomics青委會委員。
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