限制性內切酶(restriction endonuclease)全稱限制性核酸內切酶,是一種能將雙股DNA切開的酶。切割方法是將糖類分子與磷酸之間的鍵結切斷,進而于兩條DNA鏈上各產生一個切口,且不破壞核苷酸與堿基。限制酶在分子生物學與遺傳工程領域有廣泛的應用。