質粒如何提取

需要掌握技能
1. 質粒轉化
具體操作步驟：
? 將1ul 質粒DNA加入1.5ml的離心管；
? 將感受態細菌（competent cells）從－70℃冰柜中取出，快速吸取50ul感受態細菌，加入含質粒DNA的1.5ml的離心管；
? 輕輕地旋轉以混勻內容物，在冰中放置30～60 min；
? 42度熱休克90s（該時間應該非常準確，用Timer記時），冰上放置5min；
? 每管加500ul LB培養液，放37℃水浴1h；
? 吸取200ul培養物至含相應抗生素的90mm LB平板上，涂布棒將培養液涂布均勻；
? 倒置平皿，于37℃培養，12～16h后可出現菌落。
2. 質粒的抽提
具體操作步驟：
? 用前將RNase A管的液體全部加到 SolutionⅠ（加好RNaseA的溶液I一般儲存在4℃）；
? 將60ml的乙醇加到洗滌緩沖液瓶
? 37℃培養16h的平板中挑取一個單菌落（直徑2～3mm），接種到10ml LB培養液 37℃劇烈振搖培養16 h；
? 取4ml菌液到5ml 離心管，8000rpm室溫離心3min；
? 去上清，放于面巾紙上吸干痕液，
? 加250 ul Solution Ⅰ（注意用前應該加RNase A管），于渦旋振蕩器重懸細胞；
? 加250 ul 37℃預熱2-3min的Solution Ⅱ；
? 加350 ul Solution Ⅲ，將5ml離心管置于拇指和食指間柔和地反復顛倒數次；
? 將5ml離心管中的溶液倒入1.5ml 離心管中，
? 室溫孵育2-3min，12000rpm 4℃離心15 min；
? 裝配2ml 收集管（白色）和柱狀收集管（藍色）
? 將上清倒入柱狀收集管（藍色）中；
? 8000rpm室溫離心3min；
? 去掉收集管中的液體，加500ul Buffer HB 到柱狀收集管中，10000rpm室溫離心1min；
? 去掉柱狀收集管中的液體，加750ul Wash Buffer（注意用前加乙醇），10000rpm室溫離心1min；
? 重復上述步驟一次；
? 不加Wash Buffer將管子10000rpm室溫離心1min；
? 將柱狀管放到一個消過毒的1.5ml 離心管中，加65ul滅菌水，室溫放置2min，8000rpm室溫離心3min 洗提（洗脫）DNA。
3. 質粒電泳
具體操作步驟（以倒20ml的膠為例）：
? 用50ml量筒量取20ml 1XTAE；
? 用電子天平稱量0.16g瓊脂糖，并倒入20ml電泳緩沖液中；
? 將稱量紙覆蓋在裝有瓊脂糖的電泳緩沖液的三角瓶中，放入微波爐中轉1min30s，至肉眼看不到顆粒狀瓊脂為止；
? 至室溫待溶液冷卻至60度左右，將三角瓶中溶液倒入制膠盒中，并加入上樣梳子；
? 至室溫約30min膠凝固后，拔掉梳子并將凝膠安放到電泳槽內；
? 向電泳槽加入電泳緩沖液，剛好沒過凝膠約1mm；
? 將樣品中加入適量的10X上樣緩沖液，該上樣緩沖液的體積計算如下：如果樣品體積是20ul加入2ul 10X上樣緩沖液，如果是30ul，加入3ul 10X上樣緩沖液；
? 將樣品加入上樣槽中，打開電源，一般為120v，電泳約20-30min，關掉電源，在Dark Reader熒光透射儀觀察結果。