實驗材料 大腸桿菌
試劑、試劑盒 LB頂層瓊脂糖疊氮鈉第一抗體
儀器、耗材 硝酸纖維素濾膜
實驗步驟
1. 在150 ml LB 平板上滴定λgt11 cDNA文庫的滴度，宿主菌為大腸桿菌LE392菌株，每個平板使用7 ml 1%LB頂層瓊脂。
2. 選擇適當的滴度鋪平板，于37℃溫育8 h。
3. 將直徑132 mm 硝酸纖維素濾膜分別編號，放入上述已培養8 h的平板中，于37℃溫育過夜。
4. 用針頭刺孔并用印度墨汁在每張濾膜上作一標記，然后取出濾膜。
5. 在室溫用免疫篩選緩沖液洗膜30 min，以封閉濾膜并洗去膜上的殘留細菌，重復洗滌2~4次。
6. 將第一抗體（稀釋于免疫篩選緩沖液中，終濃度為0.5~10 μg/ml）加到裝有濾膜的塑料袋中，熱封口后置40℃水平搖床上反應2~24 h。
7. 于4℃用免疫篩選緩沖液洗膜4~5次，毎次5~10 min。
8. 接著將125I 標記的第二抗體（0.5×106 cpm/ml）加入裝有濾膜的熱封塑料袋中，4℃反應2~6 h。
9. 在4℃用免疫篩選緩沖液洗膜4~5次，然后用濾紙將濾膜上的液體吸干。
10. 用塑料保鮮膜包裹好濾膜，使用增感屏在-70℃對X光片曝光。
11. 通過反復稀釋，純化λ噬菌體cDNA融合蛋白克隆，最終獲得單一的陽性克隆。
12. 培養陽性克隆，制備重組λ噬菌體DNA。
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