蛋白質和多肽反相HPLC分析和純化指南（八）

肽圖分析法 - 蛋白質和多肽反相HPLC分析和純化指南

反相高效液相色譜已成為蛋白質分析和表征的標準方法，尤其是治療性藥物的分析和表征。

反相色譜分析法分辨率高，檢測靈敏度好，能夠提供大量關于蛋白質的信息。

有些時候，蛋白質作為完整的分子分析，但更多的時候采用蛋白水解酶作用于特殊的氨基酸殘基將碳骨架斷開，從而將蛋白質裂解成小片段。

隨后用反相高效液相色譜法對裂解產生的肽段進行分析。

該技術叫作肽圖分析，是一種標準的蛋白質分析方法。

通過反相色譜分析蛋白質裂解后的肽段能夠獲得蛋白質的大量信息。

通過比較表達蛋白與參照標準蛋白的肽圖能夠得出蛋白純度和表達的準確性。肽圖通常作為蛋白質治療藥物的鑒定分析工具。

通過肽圖可以確定蛋白質降解產物，如發生脫酰胺作用的天冬酰胺和氧化甲硫氨酸。

肽圖可以確認或驗證二硫鍵連接，以此得出蛋白質三級結構和療效。

肽圖能夠確定糖基化（加入碳水化合物）位點，為詳細鑒定連接在其上的寡糖提供了條件。

利用質譜檢測得到的肽圖為蛋白質鑒定、肽序列分析和數據確認提供了一種先進的手段。

在生物蛋白質組研究中，蛋白酶水解產物還用于蛋白質的鑒定和定量分析。

有許多蛋白水解酶都能斷開蛋白質的碳骨架，通常作用于特殊氨基酸殘基。包括：

胰蛋白酶是最常用的蛋白水解酶（蛋白酶）。以下為胰蛋白酶水解蛋白的五個階段：（注：參考文獻21詳細回顧了胰蛋白酶的水解）

1、變性。要在合理的時間內完成蛋白質水解，必須對蛋白質作變性處理。高溫下（37℃），將蛋白質置于6M 鹽酸胍或8M 尿素等離液劑中，在中性pH值（~7.5）緩沖液下處理30分鐘，蛋白質即可變性。

2、二硫鍵的還原。二硫鍵會阻止蛋白質的完全變性。

通常可通過在待水解蛋白的變性過程中加入濃度為~20 mM 的二硫蘇糖醇（DTT）等還原劑將二硫鍵還原。

3、游離半胱氨酸的羧甲基化。如果還原性半胱氨酸保持游離狀態，則有可能以錯誤的方式重新形成二硫鍵。

為了避免這種情況，可加入濃度為~60mM的碘乙酸等試劑，在37℃溫度下處理30分鐘，使游離半胱氨酸甲基化。該反應由100 mM DTT 退火。

4、脫鹽。當溶液中存在尿素或胍鹽時，水解反應無法進行，因為胰蛋白酶自身作為一種蛋白質會變性，失去酶活性。

尿素或胍鹽必須通過離子交換或滲析去除或將濃度降低至1M以下。

5、胰蛋白酶水解。脫鹽后，將蛋白質溶解在pH7.5~8.5（胰蛋白酶的最高活性pH）的緩沖液中——Tris或碳酸銨，并在20~100個待水解蛋白組分中加入一份胰蛋白酶，隨后在低溫至37℃的溫度區間內處理蛋白質。

低溫處理時間長達16個小時。在37℃下，水解可在1~4小時內完成，具體取決于蛋白質。

如果胰蛋白酶的時間、溫度或相對濃度均過低，則水解將不完全，一些潛在裂解可能不發生，最終導致形成含賴氨酸或精氨酸的大分子肽。

如果胰蛋白酶的水解時間、溫度或濃度均過高，則會發生胰蛋白酶自身溶解，產生“自溶產物”，即胰蛋白酶水解產生的肽段，從而造成混淆。

慣常的做法是忽略蛋白質，考慮胰蛋白酶。按照蛋白質完全水解的條件對得到的樣品進行色譜分析，了解胰蛋白酶自溶的程度以及肽圖中任何胰蛋白酶自溶肽產物的位置。

開發胰蛋白酶水解協議過程中，對胰蛋白酶和蛋白質的水解時間、溫度和相對濃度進行了優化。

當利用肽圖確定二硫鍵的位置時，必須在不還原二硫鍵的情況下水解蛋白。但在二硫鍵未被還原的情況下，許多蛋白質的水解速度非常慢。

在缺還原劑的情況下，如果水解速度很慢或水解不佳，可利用Lys-C代替胰蛋白酶，并在4M尿素中水解，維持水解過程中蛋白質的變性。

水解過程中有時采用表面活性劑維持溶液中的蛋白質，但表面活性劑會降低色譜分辨率，應盡量避免。