| 實驗步驟 | ##一、 從組織和培養細胞中分離RNA
1.TRIzol試 劑（Invitrogen)。該試劑含有苯酚和硫氰酸鹽化合物，操作時應穿實
驗服，戴手套，存放于 4°C 。
2.氯仿。
3.異丙醇。
4.乙醇。
5.焦炭酸二乙酯（DEPC) 處理的水。
6.無DNA試劑盒（Ambion)。貯存于一 20°C 。
##二、 CDNA 合成
1.Superscript? II， RNase H-反 轉 錄 酶（200 U/(nL; Invitrogen)。 一 20°C下可穩
定忙存兩年以上。
2.5X 第一鏈合成緩沖液： 250 mmol/LTris-HCI， pH 8. 3， 375 mmol/L K C l, 15
mmol,L MgCl2， 貯存于一 20。。 。
3.0. lmmol/L 二硫蘇糖醇（DTT)，貯存于一 20°C 。
4.dNTP 混合物： dNTP 各 1 0 mmol/L ，貯存于一20°C 。
5.18 堿 基 的 隨 機 引 物（25 pmol/L ): A 3， 5'-AATCATGAGCTCTCCTGG——3';B3, 5』-CATACACGCGTATACTGG——3』； C3, 5'-CCATGCGCATGCATGAGA- 3 : 貯存于一20。。。
6.RNaseOMT? 重組核糖核酸酶抑制劑 UOU/^L ; Invitrogen), I t 存于一20℃
##三、 FRAP-PCR
1.QiagenT叫 D N A聚 合 酶（5 U/|uL; Qiagen)， |^；存于一20。 C 。
2.Qiagen IOXPCR 緩沖液： Tris-HCl， KCl，（NH4)2SO4， 15 mmol/L MgCl2，p H 8.7, C 存于一20°C 。
3.25 mmol L MgCl2， I t存于一20°C 。
4.焦炭酸二異酯（DEPC) 處理過的水。
5.dNTP 混合物： dNTP 各 1 0 mmoL/L ， JC 存于一20° C 。
6.5'端用羅丹明標記的隨機引物（lOfxmol/L ; A3、 B3 或 C3)，貯存于一20°C ，避光。
7.QIAquick PCR 純化試劑盒（Qiagen)
##四、凝膠電泳
1.制膠溶液： 6 % 丙 烯 酰 胺（29: 1 丙烯酰胺-bis丙烯酰胺），含 7 mol/L 尿素和1XTBE緩沖液。
2.1父丁6￡緩沖液： 89 1^11 〇 1， 1 1 1 ^ 堿 ， 89 111111〇 1/1^硼酸， 2 111111〇 1/乙￡0丁八二鈉
鹽 ， pH 8. 3。
3.上樣緩沖液： 9 9 % 甲酰胺， I mmol/L EDTA， pH 8.0，〇. 〇〇 9% 二甲苯氰，0.009% 溴酚藍。
4.TEMED。
5.25% 過硫酸銨。
6.FDD垂直電泳系統，包 含 60孔梳子和低背景熒光的玻片（GenHunter)。
7.Sigmacote 桂 膠 液（Sigma-Aldrich)， JC存于 4°C 。
8.可提供電壓>1700 V 的直流電源。
9.突光成像掃描儀： Typhoon 9210 可 變 模 式 成 像 儀（Amersham)。
10.可打印 llin X 17in? & 的噴墨打印機，用于打印實際尺寸的凝膠圖像。
11.刀片。
##五、 PCR 產物的分離、再擴增和克隆
1.膠 原（20 叫 ZmL), C 存于_20°C 。
2.3 mol/L 乙酸鈉。
3.乙醇。
4.焦炭酸二乙酯（DEPC) 處理過的水。
5.PCR 試劑，見 2.3 (注意： lOfxmol/L 未標記的隨機引物）。
6.TOPOTA? 克 隆 試 劑 盒（Invitrogen)。 OneShot? 感 受 態 大 腸 桿 菌 貯 存 于—80°C , PCR TOPO? 克隆載體貯存于一2CTC。
7.SOC 培養基： 2 % 胰蛋白胨， 0 . 5 % 酵母提取物， 10 mmol/L NaCl， 2. 5 mmol/L KC1， 10 mmol/L MgCl2， 10 mmol/L MgSO4， 20 mmolZL 葡萄糖。
8.L B 培養基。
9.氨節西林（1 0 mg/mL)， JC存于一20°C 。
10.瓊脂。
11.X-gal (20 mg/mL)，避光忙存于_2 〇 °C 。
12.M13 引物：正 向（5'-GTAAAACGACGGCCA0 3 ' ) ，反 向（5'-CAGGAAACAGCTATGAC-3')，貯存于一20°C 。
13.QIAprep 離心法小量質粒抽提試劑盒（Qiagen)。3. 方法
##六、從組織或培養細胞提取 RNA
RNA可以從各種來源的樣本包括培養的細胞（例如神經元細胞、肝細胞等）和組織中分離得到（見 注 釋 1) 。 mRNA 的 純 化 對 FRAP-PCR 方法來說并不需要，因為mRNA 僅占細胞總 R N A 的 3 % ?5 % (13)。因而在本章所描述的方法適用于可得到的總 RNA 有 限 的 情 況 下（如少量的細胞或組織）。細胞總RNA易于純化但在用于FRAP-PCR 前需用 DNase 處理（見注釋2) 并根據每次的用量分裝于一次性管子中(見注釋3)。每次實驗總RNA的使用量均約為750ng(見注釋4)。
1.培養板每一孔的原代細胞（約 1.2 mg) 用 100 A TRIzoI 溶解，或 每 50?100mg 組織加 I mL TRIzol, 用勻漿器 Mixer Mill MM 300 (Retsch)和碳化鶴合金珠在 20 Hz 勻漿處理 2 min (見注釋 5)。
2.將勻漿后的樣品在室溫放置 5 min，使得核蛋白復合體完全解離。
3.每 I mL TRIzo 丨加人 0. 2 mL 氯仿，用手劇烈振蕩管子 15 s，室溫放置 2?3 min。
4.4°C 下 12 000 g■離心 15 min。
5.轉移上層水相（約起始 TRIzol 體積的 6 0 % ) 至一新管中，按每 Im L TRlzoI 力口0.5 m L 的異丙醇，顛倒幾次混勻。在室溫放置 10 min, 然 后 4°C ， 12 OOOg 離心 20 min。
6.移去上清，按 每 I mL TRIzol 的初始用量用 I mL 75% 乙醇洗滌 RNA 沉淀，振蕩混勻，并于 4°C , 7500 g 離心 5 min。
7.室溫下干燥 RNA，用<100 fxL的 DEPC處理過的水溶解。
8.用分光光度計測定RNA濃度。
9.為了去除基因組 D N A 的污染，在 50 反應體系中按每1 0 鴻 R N A加 5 (uLDNase I 緩沖液和 I fxL 重組 DNase I (2 UZfjtL)。 37°C 孵育 20?30 min。
10.加10 juL DNase I 滅活劑并在室溫下放置2 min，然 后 10 000 g 離 心 I.5 min,將RNA轉移人一新的離心管內。
11.再次測定RNA濃度，稀釋至75 ng/fx L ，每 管 IOfL 分裝，于一 80°C保存。
##七、CDNA 合成
在這項技術中使用了 18 堿基的隨機引物而非〇 lig0-d T 引物，以確保合成的反轉錄產物不偏向于3'端非翻譯區。這使得內部包括可讀框的 R N A序列可被反轉錄成cDNA，從而有利于下一步基因產物的鑒定。這點對于基因組序列未知的種屬有特殊的意義（如銀鷗、野鴨等)。同時，需設立不加反轉錄酶的對照，用以確定在隨后的 PCR 實驗步驟中是否有基因組 D N A 的 污 染（非反轉錄反應的對照， no RTcontro丨)。此外,商業化的 RNA (例如從轉化的大鼠成纖維細胞來源的無D N A污染的總 RNA， GenHunter) 可作為反轉錄依賴的 mRNA 擴增反應的對照（contr〇l RNA)。
1.將 10 fzL 75 ng/juL 的總 RNA 和 I dNTP 混合物， I /xL 隨 機 引 物（A 3、 B3或〇 3; 25_〇 1/乙）混合。 65°(：孵育 5 111 丨 11 ，立即置于冰浴，稍加離心。
2.加入4 pL 5X 第一鏈合成緩沖液， 2 DTT, I pL R N A 酶 抑 制 劑 RNase Out和 I /xL Superscript? ] ! 反轉錄酶。
3.在 25°C孵 育 10 min后 于 42°C孵 育 50 min.
4.70°C 加 熱 15 m in 以終止反應。
5.cDNA每 管 5 分裝，于一20°C保 存 ，用于隨后的 PCR 反 應（見 注 釋 6)。
##八、 FRAP-PCR
羅丹明是光敏性的染料，因此所有的操作過程均需要在暗處進行，包括引物、工作液及包含熒光標記物的 PCR 產物。
1.每個25 fxL的反應體系應包括： 5 pL cDNA, 2.5 fiL 10XPCR緩沖液， 1. 5 ，MgCl2， 0 ?5 fJL dNTP混合物， 1. 25 ML 羅丹明標記的引物（A3、 B3 或 C3),0. I fxL Qiagen Tag DNA 聚合酶， 14 15 pL DEPC 處理過的水。
2.PCR參數設置：
3.將 PCR 產物保存于 4°C , 暗處避光。
4.用 Qiagen PCR 清 潔 試 劑 盒（QIAquick Nucleotide Removal kit) 純化 PCR 產物(見注釋9)。
5.加125 斗 PB緩沖液至25 ;xL PCR 產物中，混勻。
6.將QIAquick柱 子 放 置 于 2 m L 收 集 管 中 ，把上 一 步 混 勻 的 樣 品 加 到 柱 子 上 ，17 900 g離心 30?60 s。
7.棄去過柱的液體，將純化柱放回收集管中。
8.加 0 ?75 m L 的 PE 緩沖液于純化柱上，離 心 30?60 s。
9.將濾液棄去，純化柱放回收集管，再 離 心 Im in 以除去殘留的緩沖液。
10.將純化柱放置于另一干凈的L 5 mL 離心管中。
11.在柱子的膜中間位置加人3〇 fxL EB緩沖液，室溫靜置Im in, 離心洗脫DNA。
##九、凝膠電泳
1.將玻片的內表面擦拭干凈，并 用 被 液 處 理 帶 有 凹 槽 的 玻 片 內 表 面 。
裝 好 玻 片 成 「三明治」，將邊緣封口以防膠聚合前泄漏。
2.配 置 6 % 的變性聚丙烯酰胺凝膠。垂 直 電 泳 系 統（長 45 cm, 寬 25 cm) 約 需 50m L聚丙烯酰胺溶液。同 時 需 加 1OO 新鮮配制的過硫酸銨和50 /xL TEMED并混勻。
3.將配置好的凝膠溶液沿著玻片上緣加人，插入加樣梳，讓其聚合過夜。在膠體溶液的上面蓋上濕紙巾和保鮮膜防止溶液蒸發干。
4.聚合后，先 在 1500 V 的電壓下預電泳45 min。上下緩沖液槽共需用約750 mL IX T B E 電泳緩沖液。
5.將3〇 /iL PCR 產物和15 FDD上樣緩沖液混勻，并設置恰當的對照（ 非轉錄反應的對照和control反轉錄依賴的mRNA擴増反應的對照），在 80°C 孵目 '2 min后 取 5 juL上 樣（見注釋 10)。上樣前，用移液器沖刷每個上樣孔。每 份樣品上樣三個平行孔。
6.在 1700 V 電泳6 h 后，取出凝膠，根據對羅丹明的操作指南，用 Typhoon成 像 儀 掃 描（激發透鏡為532 nm, 發射透鏡為580 nm BP30)。確保非轉錄反應的對照加樣孔泳道為空白，而 反 轉 錄 依 賴 的mRNA擴增反應的對照泳道有條帶出現。
7.根據實際尺寸將凝膠圖譜打印出來，將膠放于打印出的圖譜上用保鮮膜包裹整塊凝膠，以防止水分蒸發。
8.用干凈的刀片將感興趣的條帶切下，重新掃描確定切割的是正確的條帶。所切割獲取的條帶應該顯示為有/無 模 式（圖 1)。
##十、PCR產物的分離、再擴增和克隆
1.將割取的膠條置于I.5 m L離心管中，室溫下用 1〇〇斗水浸泡10 min。
2.扣緊離心管蓋子， >95°C孵 育 15 min，離 心 2 min。
3.轉移上清到另一離心管；加 入 IOyL 3 mol/L 乙酸鈉， 2.5 fxL 膠 原 Q O jl ^ ^L)和 450 y L 無水乙醇。一 80°C 放 置 30 min以上。
4.離 心 10 min 沉 淀 DNA，移去上清，用 2 0 0 斗 8 5 % 冰乙醇沖洗沉淀，離心去除殘留的乙醇。
5.用1ug DEPC水溶解沉淀，取 4uL用 于 再 擴 增 。除未標記的引物（10umol/L) 之外，再擴增反應須用與 FRAP-PCR 相同的 PCR 試劑。 PCR 循環條件為:94℃， 30 s; 54°C ， l mi n; 72 ℃， Imin; 30 個循環。
6.取 15 第二次 PCR 反應產物在1 % 的瓊脂糖凝膠上進行電泳，用溴乙 錠 染 g確定插入片段的大小（見注釋 11)。
7.用 TOPO? T A 克 隆 試 劑 盒（Inivtrogen) 將 PCR產物克隆人 pCR2.1 TOPO?載體，操作如下： 2 p i PCR產物， 0 ?5 FL pCR2. I TOPO? 載體，〇.5 鹽溶液（見注釋 12)。
8.室溫下孵育5 min, C 存于一2〇 °C 或 直 接 進 行 轉 化（步 驟 9?12)。
9.將 2 連接產物和 25 One Shot? 感受態大腸桿菌（約半管）輕 輕 混 勻（不可用移液器吹打混勻）。
10.冰浴 5?30 min。 42°C加 熱 30 s, 立即轉到冰上。
11.加 入 125 juL SOC 培養基，在 37°C ，水平搖床 200 r/min 培 養 I h。
12.取 50?75 fxL 轉化物在含有 5 0 鴻/^L 氨芐青霉素和 40 fxg/mL X-gal 的 L B 瓊脂板上涂板， 37°C 培養過夜。
13.用移液槍頭輕觸三個白色克隆的邊緣，將其分別溶于 50 水中，取 I 用M13 引物進行 PCR 反應，以鑒定陽性克隆。
14.從每一感興趣的條帶中選一陽性轉化克隆，在 LB/氨 芐 培 養 基 中 37°C 培養過夜。
15.用 Qiagen 的 QIAprep 小量質粒抽提試劑盒提取質粒并測序。
16.驗證不同基因的表達（見注釋13)。
   收起 |
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| 注意事項 | 1.細胞培養需嚴格在無菌條件下進行。移去培養基后，培養板需立即放到干冰上或放置于一80°C 直至抽提 RNA。組織的收集必須用無菌、無 RNase 污染并用3 % 過氧化氫處理過的器具。組織樣本需迅速凍存于干冰或液氮中，以防止R N A 的降解。另一選擇是將組織剪切成直徑小于〇.5 cm 的小塊，貯 存 于 RNAlater (0.1?0.2 g/mL, Ambion) 中，可 于 4-C 存放一個月或_20°C 長期保存。這對于現場就地取樣來說非常理想，省去了對干冰或液氮的依賴。
2.去除痕量的染色體 DN A 或其他來源的基因組 D N A 的污染是 FRAP-PCR 實驗成功的關鍵。在擴增反應時基因組DNA 可 與 cDNA 競爭導致 R N A 指紋圖譜的假陽性結果。對這些假陽性結果的研究將浪費大量試劑和時間。我們用 Ambion的 DNA-Free K it 可去除單鏈和雙鏈的基因組DNA，同時保持 RNA 模板的完整性。在隨后的實時定量 PCR 反應中非轉錄反應的對照未出現任何擴增產物。這個試劑盒還有一個優點就是它包含一種新的去除 DNase 的試劑，可以除去DNase 和二價陽離子，以消除它們對后續反應的影響。 DNase 和二價陽離子的去除步驟非常迅速，且不需要有機溶劑的抽提、加 入 ED TA 或 熱 滅 活（所有這些操作都可能影響 R N A 的完整性)。
3.每管分裝適量的R N A 避免隨后用于 cDNA 合成反應的R N A 反復凍融而影響R N A 的數量和質量。總 RN A 樣品經過反復凍融后凝膠電泳顯示條帶的亮度會有所降低。
4.對 FRAP-PCR 實驗最佳的總R N A 用量是通過用 200、 500、 750 和 1000 n g 預實驗結果得到的。 750 ng 結果重復性最好，條帶最清晰。但有時會遇到較高的噪聲信號比，此 時 將 R N A 總 量 降 至 375 n g 可消除背景噪聲，改善條帶的清晰度。
5.根據裂解液和裂解的組織類型，我們同時使用了不鎊鋼珠子和碳化鎢珠子來勻漿組織。我們發現 TRIzoI 會腐蝕不銹鋼珠子而 RNeasy 裂 解 液（Qiagen) 則不會。性腺、心臟和肝組織用碳化鎢珠子勻漿解離效果較好，而腦組織和甲狀腺則用不銹鋼珠子較好。
6.cDNA 分裝的原因正如 RNA 分裝的原因：避免反復凍融導致降解。 20 的反應體系得到的 cDNA 如用于4 次 FRAP-PCR反應則中間會凍融 3 次 ，第三次時就會影響凝膠圖譜，尤其是弱的條帶。
7.第一鏈合成之后，要進行一步低保真度的PCR 步驟以利于隨機引物結合到 PCR產物的兩端。這一第二鏈合成步驟確保了后面高保真 PC R 中 cDNA 產物的最佳擴增效果。
8.決 定 FRAP-PCR 中使用的具體的 1 8 堿基引物的最佳復性溫度是非常重要的。A3、 B3 的理想退火溫度是 54°C ，而 C3 則 是 56°C 。如果研究者使用本章描述之外 的 18堿基引物，則需在進行實驗之前用分析軟件（如 OligoanaIyzer) 確定其溶解溫度、 G C 含量及最佳 PCR 溫度。之后，再根據經驗確定 PCR 條件。
9.在建立 FRAP-PCR 方法的初始階段，羅丹明標記的PCR產物在電泳前并沒有經過純化。這導致所有上樣孔都出現了大片的非特異性的條帶（圖 2a)。我們推測非特異性條帶是由于多余的核苷酸和過剩的羅丹明所致。 QIAquick PCR 純化試 劑 盒（Qiagen) 可回收 100 bp?10 k b 的片段，并將小于40 b p 的片段去除。這種基于純化柱的簡易快速的方法對于除去拖尾，改善電泳結果的分辨率是非常 有 效 的（圖 2b)，應該用于所有的 FRAP-PCR實驗。在未純化的樣品中，由于非特異性條帶造成的背景會導致目的條帶的丟失。
10.上樣時盡可能不用靠近兩邊的 5 個孔。這些孔的電泳結果時常會出現拱形的條帶 ，這使得與中間上樣孔的結果很難比較。因為中間的上樣孔通常分離效果較好 ，電泳條帶清晰平整。同時，在不同處理組間空開 1?2 個上樣孔可避免電泳條帶的彌散干擾。
11.羅丹明標記的 DNA 標準物并沒有同時在測序膠上跑，因此，產物大小是在再擴增 PCR 步驟進行的。經 過 6 h 的 1700 V 恒壓電泳，在測序膠的中部切下的產物大小約在 300?750 bp 之間。在大多數情況下，從測序膠切下的條帶在再擴增 PCR 時只產生一個產物，可直接亞克隆至 TOPO 載體上。然而，一些看上去代表單一產物的條帶在用于篩選的瓊脂糖凝膠上會呈現多條帶。這種共遷移率和非特異的擴增現象可從下面兩方面來處理解決：（1）從瓊脂糖凝膠上切割下與測序膠上條帶大小相同的電泳條帶，用 QIAquick P C R 純化試劑盒(Qiagen) 純化，亞克隆純化產物或者（2） 增加測序膠電泳的時間，以提高單個條帶的分辨率，因為可能原來的條帶代表了不止一個的PCR產物。
12.根據要進一步研究的潛在靶點的數量，?轉化和克隆可能會在 FRAP-P C R 的實驗成本中占相當的比例。我們發現克隆反應可以用推薦量一半的試劑進行。比如，在連接反應時只用 0.5 的載體，連接產物轉化人半管 （25 juL) 的感受態細菌。這樣可節約試劑和成本而不影響 TOPO T A 克隆效率。
13.克隆完成后有好幾種方法鑒定差異基因表達。我們選用了一種敏感度和可靠性最高的衡量 mRNA 相對表達量的實時定量 RT-PCR 方 法（儀 器 為 MX4000,SYBR GREEN Master M ix 熒光染料）。實時定量 PCR 引物根 據 FRAP-PCR獲得的序列設計。 18SrRN A、卩-actin、甘油-3-礙酸脫氫酶（GAPDH) 作為內對照基因與目的基因的表達豐度相比較。 |
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