1、RNA切割作用
脫氧核酶最重要的一種性質，也是目前研究最活躍的一個方面，是具有通過酯化作用而切割RNA分子的功能。DNA這種獨特的性質，使其有可能應用于破壞體內細胞和病毒的RNA，具有潛在的體內治療作用。脫氧核酶發揮RNA切割作用有以下幾種形式：
（1）以金屬離子為輔因子：用“催化洗脫”的方法從一個隨機序列庫中篩選出一系列二價金屬離子依賴的具有 RNA切割作用的脫氧核酶，分別以Mg2+、Pb2+、Zn2+、Mn2+等作為輔因子。使用Ca2+、Cd2+為輔因子，同樣篩選出具有RNA切割作用的脫氧核酶，擴展了金屬輔因子的范圍。每一種結構脫氧核酶依賴的二價金屬離子種類和程度都有差別，具有特異性，這種特異性表明脫氧核酶存在一個或幾個對幾何形狀和大小尺寸有嚴格要求的金屬離子結合位點。金屬離子的作用可能是促進DNA正確折疊以形成催化中心，保持脫氧核酶處于活性狀態，穩定反應物的中間過渡態，以及屏蔽寡核苷酸所帶的負電荷，以利于酶與RNA底物雜交等。另外，三價的稀土元素鑭系金屬離子（鋱、銩、鑭）也可作為輔因子，協助脫氧核酶空間折疊和發揮催化作用。特別已篩選出的兩個Mg2+依賴的脫氧核酶，能切割所有RNA底物，分別命名為“8-17”和“10-23”，都由結合部位和催化部位組成，結合部位通過Watson-Crick堿基配對與底物RNA分子結合，而催化部位在RNA分子的一個未配對的嘌呤和一個已配對的嘧啶堿基處切割RNA，改變結合部位的堿基序列就可作用于不同底物RNA靶分子。
（2）以氨基酸為輔因子：除了金屬輔因子外，脫氧核酶還可利用氨基酸作為輔因子。篩選出了一個以L-組氨酸為輔因子的脫氧核酶，只有在L-組氨酸存在的條件下才發揮RNA切割作用，而D-組氨酸不能有效促進脫氧核酶的切割功能，說明DNA 能夠形成精確的空間結構以識別底物分子和輔因子。組氨酸作為一般堿催化劑起著獨特作用，起主要作用的是分子內的咪唑基團。另外精胺也可作為輔助因子，依賴精胺的脫氧核酶的切割機制與錘頭狀核酶相似，產生游離的5′-OH和2′,3′-環磷酸基團。
（3）自身具有RNA切割作用：不需要任何輔因子，單鏈DNA分子依靠自身的結構變化也具有RNA切割作用。已用二價金屬離子螯合劑EDTA排除二價金屬離子的污染，并進行準確的微量金屬分析，在確認沒有二價金屬離子或其他適合輔因子存在的條件下，通過“催化洗脫”的方法篩選到一個具有RNA切割作用的脫氧核酶，命名為 “G3”。與不加酶的反應相比，它提高催化效率108倍。此研究表明DNA分子自身也能提供具有活性的化學基團而發揮催化效應。
2、DNA切割作用
脫氧核酶不僅具有RNA切割作用，而且也能切割DNA 分子。已篩選出了兩類具有DNA自我切割作用的脫氧核酶，Ⅰ類自我切割脫氧核酶需要Cu2+和維生素C參與，而Ⅱ類脫氧核酶只需要Cu2+。Ⅱ類脫氧核酶以順式方式切割DNA靶分子，與不加酶的反應相比，它提高催化效率106倍。多數脫氧核酶只能與底物形成二聯體形式，而Ⅱ類脫氧核酶能與底物形成二聯體或三聯體形式，結合并切割DNA底物，通過改變二聯體或三聯體的識別位點，就可以切割不同核苷酸序列的單鏈DNA分子。因此脫氧核酶還可以作為簡單的限制性內切酶，位點特異性地切割單鏈 DNA分子。
3、卟啉金屬螯合作用和過氧化物酶活性
已篩選出一個只有24 nt富含鳥嘌呤G的脫氧核酶“PS5M”，PS5M形成一個G四聚體結構的催化活性中心，結合一個扭曲的卟啉分子，使卟啉分子類似于金屬螯合反應的中間過渡態，從而促進了金屬的螯合作用，PS5M還能與血紅素結合，形成的復合物具有過氧化物酶活性，能催化氯高鐵血紅素-氫過氧化物的分解。
4、DNA激酶活性
脫氧核酶還具有DNA激酶活性，類似T4多核苷酸激酶的作用，能把NTP或dNTP上的γ-磷酸基團轉移到DNA的5′-OH上。從一個隨機單鏈DNA庫中篩選出50個不同序列類型的具有自我磷酸化作用的脫氧核酶，都能把NTP或dNTP上的γ-磷酸基團轉移到DNA的5′-OH上，實現DNA分子5′-OH端自我磷酸化。通過優化反應條件，脫氧核酶還能區分NTP和dNTP，其中一個優化的ATP依賴的脫氧核酶能特異性地選擇ATP，高出CTP、GTP及UTP 4000倍，相對于不加酶的ATP水解反應，脫氧核酶提高催化效率106倍。