肉毒桿菌為革蘭陽性粗短桿菌，有鞭毛、無莢膜、產芽孢。芽孢呈橢圓形，比繁殖體寬，位于次極端，使細胞呈網球拍狀。
在普通固體培養基上，形成類圓形菌落，表面呈半透明、顆粒狀、邊緣不整齊、向外擴散、呈絨毛網狀，且常常擴散成菌苔。在血平板上，出現與菌落幾乎等大或者較大的溶血環。在卵黃瓊脂培養基上，可產生脂酶，在菌落表面入周圍形成彩虹薄層。
