耐熱四膜蟲的電穿孔轉化實驗

抗生素抗性細胞

Tris 抗生素復合物 HEPES

燒瓶 Cormung 塑料圓錐形試管

1. 培養適當的 2 種不同交配型的抗生素抗性細胞到對數期。

2. 以約 2X10⁵ 細胞/ml，在 10 mmol/L pH 7.5 的 Tris 中洗滌細胞，常規交配使細胞饑餓 6~24 小時。

3. 檢測每種交配型細胞密度，調為 3X10⁵ 細胞/ml。在燒瓶中混合等量的相反交配型的細胞，體積適當，以確保固定時通氣量合適。

4. 添加抗生素復合物，用鋁箔或棉絮塞子蓋上燒瓶。

5. 開始交配，讓細胞在 30℃ 靜置。

6. 4~6 小時后，檢測交配效率。如細胞配對超過 80%，接著進行轉化步驟。

7. 交配 10 小時后，將細胞轉到 50 ml 的 Cormung 塑料圓錐形試管中，用 pH 7.5 的 10 mmol/L HEPES 輕輕洗滌細胞。

8. 在 10 mmol/L HEPES 中重懸細胞到約 3X10⁷ 細胞/ml。

9. 在 HEPES 緩沖液中混合 125 μl 細胞和 125 μl 準備好的質粒 DNA，立即進行電穿孔。

10. 用 0.2 cm 的樣品池，電壓設為 250 V，電容 275 mF，電阻 13 歐姆。

11. 在室溫下樣品池靜置 1 分鐘，然后用添加了抗生素混合物的在 20 ml SPP 中重懸細胞。

12. 用 SPP 系列稀釋細胞，將 25 ml 加到含有添加了抗生素混合物的 175 μl SPP 的 96 孔微量滴定板中。

13. 12~18 小時后，在所選的每個轉化孔中加入 50 μl 巴龍霉素，600 μg/ml 10 mmol/L HEPES，或另一種抗生素。

14. 4~5 天后，用 Poisson 分布計算轉化產量。