干細胞計數是根據血液中不同血細胞的特性，選擇特異性標記物，采用多參數分析的方法，排除細胞之間的干擾，識別出不同的細胞并分類計數。具體而言，針對干細胞核酸含量高、大小與大淋巴細胞相近、粒度與淋巴細胞相似、CD45 表達弱、CD34 表達強的特點，首先可通過核酸染料標記所有的有核細胞(包括白細胞和幼稚的紅細胞)，排除細胞碎片及無核細胞；其次通過抗CD45抗體標記所有白細胞，并根據CD45表達強度的不同區分不同的白細胞，從而排除CD45表達強的細胞，避免CD45弱表達細胞的丟失；然后用抗CD34抗體標記CD34陽性表達的細胞，即干細胞。總之，通過核酸量、SSC的強度、CD45和CD34的表達量等多個參數將干細胞與淋巴細胞、單核細胞、粒細胞、死細胞、細胞碎片、血小板團塊以及紅細胞區別開來。
同時，樣品管中還加有已知數量的三色標記的易于與細胞區分的熒光微球作為絕對計數的內標。根據所采集到的干細胞數與熒光微球數目的比值，再乘以樣品管中的熒光微球數，即為樣品管中干細胞的數目，再除以樣品的體積，即可求得樣品中干細胞的濃度。