細菌基因組DNA提取試劑使用說明（二）

三.組織或液體樣品中細菌DNA提取

該方案適合于從各種組織、血液、分泌液等液體樣品中提取基因組DNA和寄生的細菌DNA。純化的DNA可直接用于各種細菌的檢測。若需從糞便樣品中提取細菌DNA，我們推薦使用DePure Stool DNA Kit，若需要從土壤樣品中提取細菌DNA，推薦使用DePure Soil DNA Kit。

固體樣品：將10mg固體樣品剪切成小碎片，并轉移至1.5ml離心管中，加入200μl Buffer STE和10μl Buffer SDS。
全血樣品：取<1ml抗凝血液按常規流程分離得到細胞和細菌。加入200μl Buffer STE和10μl Buffer SDS，用移液槍吸打重懸細胞。
分泌物或血清等: 10,000 × g離心3分鐘收集細胞和細菌；倒棄上清液，加入200μl Buffer STE和10μl Buffer SDS，用移液槍吸打重懸細胞。
粘稠的分泌液：取100μl或100mg 痰液等，加入100μl Buffer STE，10μl Buffer SDS和5 μl 1M 二硫蘇糖醇DTT。（若需要從痰液中分離結核桿菌或真菌，可先用NaOH進行痰液液化，離心收集得到沉淀后再進行操作。）

加入10μl Proteinase K至重懸液中。渦旋混勻。55℃水浴1-3小時或直至樣品完全消化。按細菌和細胞總DNA的提取流程，或難裂解細菌提取流程進行操作。

細菌和細胞總DNA提取

難裂解細菌DNA提取

10,000rpm離心3分鐘收集未消化的細菌。吸棄所有的上清液。
加入200μl Buffer STE和30μl Lysozyme至細菌沉淀團中。渦旋充分重懸細菌，37℃水浴30-60分鐘。處理葡萄球菌屬的細菌時，最好再加入1μl Lysostaphin(20mg/ml)。
加入20μl Buffer SDS至細菌重懸液中。渦旋混勻，95℃水浴10分鐘。
加入250μl Buffer DL和250μl無水乙醇至裂解液中。最高速度渦旋30秒。按第7-12步進行操作。

過柱吸附DNA

注：若吸附柱出現堵塞，提高離心速度至13,000rpm，離心3分鐘。

注：Buffer GW2須用無水乙醇稀釋。按瓶子標簽或說明書指示進行稀釋。

12. 丟棄DNA結合柱，DNA保存于2-8℃，長期保存需保存于-20℃。

四.拭子樣品中細菌總DNA提取

該方案適合于從各種拭子樣品中提取基因組DNA和總細菌DNA。

轉移拭子樣品至2ml離心管中。加入350μl Buffer STE和30μl Lysozyme至拭子樣品中。渦旋充分重懸細菌，37℃水浴10-30分鐘。處理葡萄球菌屬的細菌時，最好再加入1μl Lysostaphin(20mg/ml)。
加入30μl Buffer SDS和10μl Proteinase K至細菌重懸液中。渦旋混勻，65℃水浴消化30分鐘。
(可選)95℃水浴10分鐘進一步裂解難裂解的細菌。
加入400μl Buffer DL和400μl無水乙醇至裂解液中。渦旋20秒。
把DNA柱裝在收集管中。轉移600μl混合液(第4步獲得的混合液)至吸附柱中。10,000rpm離心1分鐘。
倒棄流出液，把吸附柱裝回收集管中。把剩余的混合液轉移至吸附柱中。10,000rpm離心1分鐘。
倒棄濾液，把吸附柱重新裝回收集管中。加入650 μl Buffer GW2(已用乙醇稀釋)至吸附柱中。10,000rpm離心1分鐘。

注：Buffer GW2須用無水乙醇稀釋。按瓶子標簽或說明書指示進行稀釋。

9. 將吸附柱裝在新的1.5ml離心管中。加入30-50μl預熱至65℃ Buffer AE至吸附柱膜中央。放置3分鐘。10,000rpm離心1分鐘。丟棄DNA結合柱，DNA保存于2-8℃，長期保存需保存于-20℃。

【注意事項】

1．實驗過程中穿戴工作服、乳膠手套和口罩，使用移液器，試驗產生的所有廢棄物及時處理。

2．請嚴格按照操作步驟操作，如有技術問題，請及時與我們聯系。

3．請在有效期內使用試劑盒。