細胞凋亡的檢測方法綜述3

4、DNA 5’末端32P標記
（1）將脫磷酸樣品DNA置冰浴上，再加雙蒸水10μl，10×緩沖液2μl，T4多核苷酸激酶10U，32P-ATP 740kBq（20μCi），雙蒸水加至20μl。
（2）混合后，37℃水浴60min。
（3）加入1μl的0.5mol/L EDTA，90℃滅活5min。
5、觀測
（1）取一定量的標記DNA稀釋后在1.8％瓊脂糖凝膠上點樣，50V電泳約2h。
（2）電泳后的凝膠置濾紙上烘干，進行放射自顯影。
（3）含32P標記DNA電泳干凝膠進行同位素液閃測定，計算放射活性。
6、結果判斷：
正常活細胞DNA 電泳出現階梯狀（LADDER）條帶；壞死細胞DNA電泳類似血抹片時的連續性條帶。
三、酶聯免疫吸附法（ELISA）核小體測定
凋亡細胞的DNA斷裂使細胞質內出現核小體。核小體由組蛋白及其伴隨的DNA片斷組成，可由ELISA法檢測。
（一）檢測步驟
1、將凋亡細胞裂解后高速離心，其上清液中含有核小體；
2、在微定量板上吸附組蛋白體；
3、加上清夜使抗組蛋白抗體與核小體上的組蛋白結合；
4、加辣過氧化物酶標記的抗DNA抗體使之與核小體上的DNA結合；
5、加酶的底物，測光吸收制。
（二）用途
該法敏感性高，可檢測5*100/ml個凋亡細胞。可用于人、大鼠、小鼠的凋亡檢測。該法不需要特殊儀器，適合基層工作，但是不能精確測定凋亡細胞發生的絕多對量。
四、流式細胞儀定量分析
（一）檢測原理
細胞發生凋亡時，其細胞膜的通透性也增加，但是其程度介于正常細胞與壞死細胞之間。利用這一特點，被檢測細胞懸液用熒光素染色，利用流式細胞儀測量細胞懸液中細胞熒光強度來區分正常細胞、壞死細胞核凋亡細胞。
（二）應用價值
流式細胞儀檢測具有以下特點：
1、檢測的細胞數量大，因此其反映群體細胞的凋亡狀態比較準確
2、可以做許多相關性分析
3、結合被檢測細胞的DNA含量的分析，可確定凋亡的細胞所處的細胞周期
（1）檢測形態學及細胞膜完整性的Hoechs-PI雙染色法
細胞發生凋亡時，其細胞膜的通透性液增加，但其程度介于正常細胞和壞死細胞之間，利用這一特點，被檢測細胞懸液用熒光素染色，利用流式細胞儀檢測細胞懸液中細胞熒光強度來區分正常細胞、壞死細胞和凋亡細胞。
利用Hoechs-PI染色法，正常細胞對染料有抗拒性，熒光染色很淺，凋亡細胞主要攝取Hoecha染料，呈現強藍色熒光，而壞死細胞主要攝取碘化丙啶（PI）而呈強的紅色熒光。
（2）DNA片斷原位標記法
凋亡細胞DNA片斷原位末端檢測技術是指在細胞（或組織）結構保持不變的情況下，用熒光素、地高辛或生物素標記的脫氧尿三磷酸（deoxyuridinetriphate，DUTP）和末端脫氧核苷酸轉移酶（TdT）相反應與凋亡細胞裂解后3·的羥基（－OH）端結合，經顯色反應后檢測DNA裂解點的技術。