細胞凋亡的檢測方法綜述2

方法三
（1）收集細胞懸液（106細胞），低速離心（1000r/min，離心5min）。
（2）去上清，沉淀加0.4ml低滲緩沖液作用1h。
（3）13 000r/min，離心10min，將上清轉移至另一Eppendorf管中，加等量50％異丙醇和0.5mol/L NaCl混勻，置液氮5min。
（4）12 000r/min，離心10min，棄上清，沉淀真空抽干。
（5）加TE 100μl，65℃加熱10min，取20μl，加1～2μl上樣緩沖液，電泳觀察。
方法四
（1）收集細胞，1000r/min離心5min，去上清。
（2）用冰預冷的70％乙醇固定，可長期保存于－20℃冰箱。
（3）1000r/min離心5min，去除固定液，用約0.5ml的PBS重懸細胞。
（4）轉入Eppendorf管中，同法離心，去上清。
（5）細胞用40μl PC緩沖液重懸，室溫30～60min。
（6）1000r/min離心5min，吸上清于新的Eppendorf管中，真空濃縮15min。
（7）加入0.25％ NP-40溶液3μl，1mg/ml RNase A溶液3μl，37℃，30min。
（8）加入3μl蛋白酶K，37℃，30min。
（9）加入12μl樣品稀釋液，含溴化乙錠的1.5％瓊脂糖電泳，觀察
2、瓊脂糖凝膠電泳的定量檢測
方法一：簡易末端標記法
（1）按常規提取細胞DNA。
（2）在0.5ml的EP管中加入細胞DNA，反應體系如下：細胞DNA 0.5～1.0μg，10×緩沖液2μl，32P-dATP（或-dCTP）0.5μCi，Klenow聚合酶5U，雙蒸水加至20μl。
（3）混勻后稍加離心，室溫反應30min。
（4）加1μl 0.5mol EDTA終止反應。
（5）常規酚/氯仿/異戊醇抽提1次，無水乙醇沉淀DNA，真空抽干。
（6）溶于20μl的TE緩沖液中。
（7）取標記DNA在1.8％瓊脂糖凝膠上點樣，50V電泳約2h。
（8）電泳后的凝集置濾紙上烘干，進行放射自顯影。
方法二：5’末端32P標記法
細胞DNA的提取
（1）細胞懸液離心后，沉淀加消化緩沖液0.5ml，50℃ 3～5h，或37℃過夜。
（2）用等體積的酚：氯仿：異戊醇抽提細胞裂解液。
（3）將水相轉移至新的試管，加入150mmol/L乙酸鈉和10mmol/L氯化鎂。
（4）加入2倍體積的預冷無水乙醇，置液氮5min或－20℃ 12h。
（5）12 000r/min離心沉淀DNA，70％乙醇洗1次后，真空抽干。
（6）溶于20μl的TE緩沖液中。
（7）加入終濃度為10μg/ml RNase，37℃，30min。
（8）同法用等體積酚：氯仿：異戊醇抽提，乙醇沉淀，真空抽干。
（9）溶液20μl的TE緩沖液中，－20℃保存備用。DNA含量測定：用260nm波長紫外分光光度計：吸光單位為20時約為1mg/ml DNA。
3、DNA 5’末端脫磷酸
（1）取純化的細胞DNA 10μg，然后加入：10×CIP 2μl（1U），雙蒸水加至50μl。
（2）37℃水浴2h。
（3）90℃水浴5min以滅活CIP。
（4）用等體積酚：氯仿：異戊醇抽提，乙醇沉淀，真空抽干。