細胞凋亡檢測操作流程三JC1檢測凋亡細胞線粒體膜電...

細胞凋亡檢測操作流程三--JC-1檢測凋亡細胞線粒體膜電位改變

凋亡檢測操作流程
  
三、JC-1檢測凋亡細胞線粒體膜電位改變

BD? MitoScreen (JC-1)線粒體膜電位檢測試劑盒（551302）：

試劑準備：  

A.10× Assay Buffer的稀釋（Assay Buffer作為實驗的反應液用于清洗細胞） ：   

a) 使用前將10× Assay Buffer置于37°C水浴箱中至溶解。

b) 用雙蒸水1：10稀釋10× Assay Buffer，攪拌5分鐘。

c) 使用前將1× Assay Buffer 在37°C預熱。

JC-1儲存液的配制（一瓶）： 

a) 室溫下每瓶用125μl DMSO 稀釋JC-1凍干粉。反復倒置混勻小瓶使JC-1充分溶解。

b) 儲存液應立即稀釋為工作液或分裝成小份（避光操作），-20°C保存（可長達6個月）。

c) 避免反復凍融JC-1儲存液。

JC-1工作液的配制：

a) 37°C預熱1× Assay Buffer。

b) 用1× Assay Buffer 1：100稀釋 JC-1儲存液至JC-1工作液。例如將125μl的JC-1儲存液加入 12.375ml 預熱的1× Assay Buffer中。 實驗操作時，每個樣本（<106細胞）需要0.5ml的JC-1工 作液。

 c) 輕柔混勻JC-1工作液待用。（混勻后可能會出現少許JC-1聚集微粒，但并不影響流式檢測。也可在室溫13,000g離心3分鐘或 1，000g 離心15分鐘去除JC-1團絮。）

實驗操作：

1.制備1x106 /ml的細胞懸液， 濃度不宜過高，因為超過該濃度容易造成細胞的凋亡。

2.誘導細胞進行凋亡的處理，同時保留一份未經誘導的細胞作為對照。

3.凋亡處理結束后，每個無菌的15ml聚苯乙烯離心管中加入1ml細胞懸液，室溫下，400×g ，離心5分 鐘，棄上清。 

4.每管加入0.5 ml 新鮮配制的JC-1工作液，充分混勻后置于37°C的CO2培養箱，孵育10-15分鐘。

5.按以下步驟洗滌細胞兩次：

  第一次：每管加體積為2 ml的 1× Assay Buffer，輕輕懸浮細胞，振蕩或用槍頭使細胞分散，以免細 胞聚集成塊。400×g ，室溫離心5分鐘，棄上清。

  第二次：每管加體積為1ml的 1× Assay Buffer，輕輕懸浮細胞，振蕩或用槍頭使細胞分散，以免細 胞聚集成塊。400×g ，室溫離心5分鐘，棄上清。 

6.每管加體積為0.5 ml的 1× Assay Buffer，輕輕懸浮細胞，上機檢測。