離體神經突觸的代謝性標記實驗

固定劑 溫育液 氯霉素 放射自顯影乳劑 顯影劑 SDS樣本緩沖液

一、放射自顯影

神經元在條件培養基中培養 2d，如第十章所述。

1.用一個鋒利的微電極從胞體分離神經突起，并用牽引電極將胞體移出培養皿 (見第十章)。

2.在培養液中加入終濃度 0.lmmol/L 氯霉素，阻斷線粒體蛋白的合成。

3.小心移去培養液并用溫育液洗滌 6 次，每次 Imin。保證軸突始終被一小部分液體覆蓋；一旦干了，軸突便會崩解。

4.在含 0.5mCi/ml 反式-³⁵S 和 0.1 mmol/L 氯霉素的溫育液內標記 30 min。

5.用含 lmol/L 未標記半胱氨酸和蛋氨酸以及 0.1_d/L 氯霉素的溫育培養液洗漆 6 次，每次 40 min。

6.用 1% 的多聚甲醒和 1% 的乙酸固定 2 h。

7.用一系列濃度遞增乙醇脫水。

8.于空氣中干燥。

9.浸入放射自顯影乳劑。

10.曝光 2~7 山具體時間根據 35S 標記摻入蛋白的速度而定。

11.D19 中顯影。

12.水中短暫漂洗。

13.20%Na₂S₂O₃(硫代硫酸鈉）水溶液固定。

14.水洗漆 20 min。

15.封片液或甘油封片。

二、聚丙烯酰胺凝肢電泳

1.從胞體分離神經突起并去胞體。

2.0.1 mmol/L 氣霉素預溫育分離的神經突起 30 min。

3.用溫育液洗漆 6 次，每次 Imin。

4.在含 0.5mCi/ml 反式-³⁵S 和 0.1 mmol/L 氯霉素的溫育液內標記 2.5 h。

5.溫液洗滌 6 次，每次 30 min。

6.20ul SDS 樣本緩沖液收集神經突起，并轉移入微量離心管。

7.煮沸 5 min。

8.樣本于 12OOOr/min, 離心 2 min。

9.取上清液加樣到 8% SDS-PAGE 進行電泳。

10.50% 甲醇和 10% 乙酸固定凝膠 30 min。

11.用擴增儀處理凝膠 20 min。

12.千燥凝膠。

13.在 X 射線膠片（KodakBiomaxMS) 上曝光 1~3 周。

14.顯影膠片

三、結果

為了解神經突起內蛋白的合成部位以及這些部位合成蛋白的異質性，我們應用反式-³⁵St 示記技術通過 ³⁵S 標記的半胱氨酸和蛋氨酸標記了離體神經突起。如果離體軸突確實存在蛋白合成，那么這些放射標記的氨基酸將能夠摻入蛋白，并被放射自顯影方法檢測到。結果證明神經突起能夠合成各種各樣的蛋白，而且這個過程主要發生在曲張體和生長錐（圖 3-6)。