實驗材料 指數生長的哺乳動物細胞
試劑、試劑盒 CaCl2氯喹Giemsa 染液甘油HEPES 鹽緩沖液甲醇磷酸鹽緩沖液丁酸鈉TE質粒 DNA細胞生長培養基
儀器、耗材 組織培養皿（60 mm) 或 12 孔板
實驗步驟
材料
緩沖液與溶液
貯存液、緩沖液與試劑的成分見附錄 1。
稀釋貯存液至所需濃度。
CaCl2(2.5mol/L)
氯喹（100 mmol/L)(選用）
溶解 52 mg 二磷酸氯喹于 1 ml 去離子水，用 0.22um 的濾器過濾除菌。用箔紙包裹好存放濾液的試管，-20°C 保存。見步驟 5。
Giemsa 染液（10%m/V)
Giemsa 染液應是使用前用磷酸鹽緩沖液或水新制備的，用 Whartman1 號濾紙過濾。
甘油（15%V/V)1XHEPES 鹽緩沖液溶解（備選）
HEPES 鹽溶液過濾除菌，使用前加入高壓滅絕的 15% 的甘油。見步驟 5。
2XHEPES 鹽緩沖液
140 mmol/LNaCl
1.5 mmol/LNa2 HPO4?2 H20
50 mmol/L.HEPES
于 90 ml 蒸餾水中溶解 0.8 gNaCl,0.027 gNa2 HPO4?2 H20,1.2 gHEPES, 用 0.5mol/LNaOH 調節 pH 至 7.05, 用蒸餾水將體積補至 100 ml, 用 0.22um 的濾器過濾除菌；分裝成 5 ml 等份，-20°C 保存，1 年內使用。
甲醇
磷酸鹽緩沖液
溶液使用前過濾除菌. 室溫保存。
丁酸鈉（500 mmol/L)(備選）
在化學通風櫥內，用10mol/LNaOH 調節丁酸貯存液至 pH7.0。用 0.22um 的濾器過濾除菌；分裝成1 ml 等份，-20°C 保存，見步驟 5。
0.1XTE(PH7.6)
1 mmol/LTrLi-Cl(pH7.6)
0.1 mmol/LEDTA(pH7.6)
用0.22um的濾器過濾除菌，分裝，4°C 保存。
核酸與寡梭苷酸
質粒 DNA
用 0.1XTE(pH7.6) 溶解 DNA 至終濃度 25ug/ml; 每毫升培養基需要 50ul 質粒溶液。質粒 DNA 應用層折柱（見第 1 章方案 9) 或 CsCl-溴化乙錠梯度離心（見第 1 章方案 10) 純化以獲得最高轉化效率。如果質粒 DNA 起始有限，可加入載體 DNA 將終濃度調至 25ug/ml。實驗室內制備的真核運載 DNA 的轉染效率通常比購買的 DNA 如小牛胸腺或鮭精 DNA 的轉染效率高。運載 DNA 使用前通過乙醇沉淀或氯仿抽提除菌。
培養基
細胞生長培養基 [完全培養基與（優化備選）選擇性培養基]
特殊設備
組織培養皿（60 mm) 或 12 孔板
本方法適用于 60 mm 組織培養皿或 12 孔板培養細胞。如果使用其他多孔板，細胞瓶或其他直徑的培養皿，按比例改變細抱濃度與試劑的用量。見表 16-3。
輔助試劑
步驟 6 所需試劑見第 6 章方案 10, 第 7 章方案 8。
細胞與組織
指數生長的哺乳動物細胞
方法
1. 轉染前 24 h，通過胰酶消化收集細胞，用適當的完全培養基以 1x105 至 4x105 細胞/cm2 的密度平鋪細胞于 60 mm 組織培養皿或 12 孔板上。于含 5%~7%CO2 的 37°C 溫箱孵 20~24 h。轉染前1h 換液。
為得到較高的轉染效率，注意使用指數生長的細胞，轉染時細胞的匯合度不能超過 80%。
2. 按照下述方法制備磷酸鈣-DNA 沉淀：于 5 ml 滅菌塑料管內混合 100ul 2.5mol/LCaCl2 與 25ug 質粒 DNA，如有必要用0.1xTE(pH7.6) 將體積補至 1 ml。室溫下將以上 2x 鈣-DNA 溶液與等體積的 2xHEPES 鹽溶液混合。迅速彈敲試管側壁混勻溶液，靜置 1 min。
如果轉染大量細胞，可以將沉淀反應混合物的體枳擴大至兩倍或 4 倍，通常，培養皿、孔或細胞瓶內毎 1 ml 培養基加 0.1 ml 磷酸鈣-DNA 沉淀物。
3. 立即將磷酸鈣-DNA 懸液轉移至上述單層細胞的細胞培養基中。每 1 ml 培養基加 0.1 ml 懸液。輕輕搖動平皿混勻培養基，培養基會變成混濁的橘黃色。一旦形成 DNA 沉淀，轉染效率會大大降低，因此此步動作應盡可能迅速。如果是用氯喹、甘油與/或丁酸鈉處理細胞，直接進行步驟 5。
有時候，先去掉培養基再直接加入磷酸鈣-DNA 于暴露的細胞上會得到較髙的轉染效率。然后，室溫下孵育細胞 15 min, 再加入培養基。
4. 如果轉染的細胞不用轉染促進劑處理，則置于含 5%~7%CO2 的 37°C 溫箱孵育。2~6 h 后，吸去培養基與 DNA 沉淀。加人 5 ml 37°C 預熱的完全培養基，將細胞放回孵箱孵育 1~6 天。繼續步驟 6 檢測轉染 DNA 的瞬時表達，或者如果是穩定轉化則直接進行步驟 7。
5. 在磷酸鈣-DNA 沉淀物的存在下用氯喹處理細胞或者吸去共沉淀溶液后將細胞暴露于甘油與丁酸鈉中會促進細胞吸收 DNA。
用氯喹處理細胞
氯喹是一種弱堿，推測是通過抑制細胞內溶酶體水解酶降解 DNA 而發揮作用 (Luthman and Magnusson 1983)。細胞對氯喹毒性的敏感度限制了培養基中加入氯喹的濃度及時間，不同細胞所需氯喹最佳濃度根據經驗而定（見信息欄二磷酸氯喹)。
a. 在把磷酸鈣-DNA 沉淀物加入細胞前或后按 1:1000 將 100 mmol/L 氯喹直接加入培養基中。
b. 細胞于含 5%~7%CO2 的 37°C 溫箱中孵育 3~5 h。
大多數細胞可在氯喹中生存 3~5 h。氯喹處理的細胞多呈泡狀。
c. 在用 DNA 與氯喹孵育細胞后，移去培養基，用磷酸鹽緩沖液洗滌細胞，加 5 ml 預熱的完全培養基。細胞于孵箱中培養 1~6 天。繼續步驟 6 檢測轉染 DNA 的瞬時表達，或者直接進行步驟 7 以獲得穩定轉化子。
用甘油處理細胞
此操作可在氯喹處理后進行。由于細胞對甘油毒性的敏感度不同，應在使用前先測試最佳處理時間（30s 至 3 min)。
a. 在把磷酸鈣-DNA 沉淀物加入細胞 2~6 h 后（±氯喹)，吸去培養基，磷酸鹽緩沖液洗滌細胞層。
b. 每平皿細胞加 1.5 ml 15% 甘油 1xHEPES 鹽緩沖液，依據事先測試的最佳時間于 37°C 孵育細胞。
c. 吸去甘油，磷酸鹽緩沖液洗滌細胞一次。
d. 加 5 ml 預熱的完全培養基。細胞于孵箱中培養 1~6 天。繼續步驟 6 檢測轉染 DNA 的瞬時表達，或者直接進行步驟 7 以獲得穩定轉化子。
丁酸鈉處理細胞
丁酸鈉的作用機制并不確定；但它是組蛋白脫乙酰基抑制劑（Lea and Randolph 1998), 推測丁酸鈉會導致組蛋白過乙酰化形成使外來質粒 DNA 趨于轉錄的染色質結構（Workman and Kingston 1998)。
a. 甘油休克處理后，將 500 mmol/L 丁酸鈉直接加入生長培養基（甘油處理的步驟 d)。細胞類型不同，所用丁酸鈉的濃度也不同。例如：
CV-1 10 mmol/L
NIH-3T 37 mmol/L
HeLa 5 mmol/L
CHO 2 mmol/L
其他細胞系所需濃度依經驗而定。
b. 細胞于孵箱中培養 1~6 天。繼續步驟 6 檢測轉染 DNA 的瞬時表達，或者直接進行步驟 7 以獲得穩定轉化子。
6. 若要檢測細胞轉染后導入 DNA 的瞬時表達，可在轉染后 1~6 天收獲細胞。雜交分析 DNA 或 RNA。通過體內代謝標記進行放射免疫、免疫印漬、免疫沉淀或測定細胞提取物的酶活性來分析新合成蛋白。
為減小不同培養皿之間轉染效率的差異，最好（1）用每一構建體轉染數個培養皿；（2）孵育 24 h 后用胰酶消化細胞；（3）將細胞匯集起來；以及（4）重鋪細胞于數個培養皿上。
7. 分離穩定轉染體
a. 用非選擇性培養基中孵育細胞 24~48 h, 使轉染的 DNA 有足夠時間表達。
b. 胰酶消化細胞并重鋪細胞于選擇性培養基中，或者直接加選擇性培養基。
c. 每 2~4 天更換培養基，持續培養 2~3 周，目的是清除死細胞殘骸，促進抗性細胞生長。
d. 克隆獨立菌落、繁殖，以用于檢測（方法見 Jakoby and Pastan 1979 或 Spector et al.1998b[《細胞實驗手冊》的第 86 章])。
e. 用預冷的甲醇固定細胞 15 min, 然后室溫下用 10%Giemsa 染色 15 min, 流水沖洗，這樣可以紀錄細胞克隆數目。
根據穩定轉染效率確定轉染細胞的稀釋度，重鋪細胞產生獨立克隆，不同細胞系的轉染效率會相差幾個數量級（如見 Spandidos and Wilkie 1984)。轉染效率決定于細胞類型 [既使同一細胞系的不同克隆或不同傳代數也可能出現顯著差別（Corsaro and Pearson 1981，Van Pel et al.1985)]、導入 DNA 的性質及相關轉錄控制信號的功效、用于轉染的 DNA 量